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脐带血造血干细胞的分离与贮藏工艺过程研究

作者:admin 日期:2019-01-31 10:21:40 点击:580

     

 

造血干细胞(hemopoietic stem cell, HSC)在组织内并不是固定的细胞成员,而是作为一群原始的造血细胞被造血组织所包含,同时也能在造血组织及血液中生存。在生长到第二周的人类胚胎的卵黄囊内,造血干细胞就出现了,当人类胚胎发育到第四周的时候,造血干细胞开始在胎肝中出现。当孕妇怀孕达到五个月时,幼体骨髓中的造血功能开始运转,在人类出生后,骨髓就成为了造血干细胞存在的主要场所和主要来源地。根据造血干细胞来源地不同可将造血干细胞移植分为骨髓造血干细胞移植,脐血造血干细胞移植和外周血造血干细胞移植三个组别。没有供者限制这一点就是使用自体脐带血造血干细胞移植的最大优点,并且在移植过后,发生移植物抗宿主病的几率非常小,免疫抑制剂的使用量也大幅减少,几乎没有出现严重并发症,并且费用较低,因此很多用户都选择去储存自体脐带血。

 

本文主要通过实验来研究造血干细胞在提取储存过程中的各种影响因素。

 

第一部分研究了脐带血采集量和分离到的单个核细胞数之间的关系。通过 6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),统计结果显示,脐带血采集量与分离收集的 MNC 数量之间线性相关,r = 0.985P< 0.0001。因此,在不对母婴造成影响的前提下,尽量多的采集脐带血可以增加收集分离的有 MNC 数量,进而满足移植的需要。

 

第二部分主要研究脐带血不同分离方法对造血干细胞分离效果的影响,本部分首先分析了 Ficoll 分层法、6%羟乙基淀粉密度梯度离心法和 6%羟乙基淀粉自然沉降法三种方法分离脐带血造血干细胞的效果,结果显示,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法分离得到的 MNC 数量最多,6%羟乙基淀粉自然沉降法次之,Ficoll 分层法最低。对分离得到的 MNC 进行半固体琼脂培养,统计的 CFU-GM 集落数据显示 6%羟乙基淀粉密度梯度离心法要明显高于其它两种方法。同时,本部分还对获得的 MNC 中细胞表型进行对比,与其他两种方法相比,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法会分离得到更多的 CD3+CD14+CD34+细胞。综合上述实验结果可知,6%羟乙基淀粉密度梯度离心法是相对理想的脐带血造血干细胞分离方法。根据文献报道,多种因素会对6%羟乙基淀粉密度梯度离心法的分离效果造成影响。本研究利用响应面法对离心温度,离心力,离心时间三个影响因素进行了分析优化,最终得到在离心温度 15℃、离心力 1000g 及离心时间 17.8min 时分离效果最佳,此时分离的细胞活力可达到

 

95.7%

 

第三部分主要研究不同的冻存方法对造血干细胞冻存质量的影响。脐带血造血干细胞低温保存是脐带血库建设和临床移植成功的前提条件。目前,慢速分步冷却法是脐带血干细胞保存的主流方法。在该方法中,降温过程不同对复苏后细胞活力影响很大。本研究选取降温速率,降温时间及降温的终点温度作为三因素探究最佳的降温过程,响应面法结果显示,在降温速率为 1.5/min、降温时间 40h、降温终点温度为-80℃条件下,细胞复苏后活力可达到 98.7%。由于快速降温,不产生冰晶和对细胞损伤小,玻璃化法在脐带血造血干细胞的长期保存方面展现出良好的应用前景。本论文对玻璃化法进行了初步的研究。根据文献报道,抗冻剂的种类和添加量,抗冻剂滴加速度以及滴加时的温度都会对玻璃化法冻存的细胞活性产生影响。本实验对抗冻剂人血清白蛋白添加浓度,滴加速度和滴加温度进行了优化,结果显示,在人血清白蛋白终浓度为 17.1%、滴加温度为-8.32℃、滴加速度为 2.84%/min 条件下进行造血干细胞玻璃化冻存,最终细胞复苏活力为 99.1%

 

关键词   造血干细胞;密度梯度离心法;单个核细胞数;台盼蓝法


 

 

Abstract

 

Hemopoietic stem cellHSCis a group of primitive hematopoietic cells found in hematopoietic tissue. It is not a tissue fixed cell and also can be found in hematopoietic tissue and blood. Hematopoietic stem cells appear in in the yolk sac of 2 weeks’ human embryo and then shift to the embryo liver after 4 weeks. pregnancy later, the bone marrow hematopoietic begin to work after five months and function as the main site after birth.

According to the sources of hematopoietic stem cells, the transplantation could be classified as bone marrow hematopoietic stem cell transplantation, cord blood hematopoietic stem cell transplantation and peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation. Because of the advantage of autologous cord blood hematopoietic stem cell transplantation, such as no limited by donor, less graft versus host disease, low dose of immune inhibitor usage, less serious complications and low cost, the storage of autologous cord blood become many people’s choice.

 

Hematopoietic stem cells separation and storage process have been studied in this paper.

 

In the first part, mainly clarified the relationship between umbilical cord blood amount and number of mononuclear cells were clarified. The umbilical cord blood was separated by the method of 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation. By counting the number of mononuclear cells, we found there are linear correlation between umbilical cord blood amount and number of mononuclear cells (r=0.985, P< 0.0001). That means, in the premise of having no effect on mother and baby, the more umbilical cord blood is collected, the more mononuclear cells will be separated, which further ensure Success rate of transplantation.

 

The second part in this paper showed the effect of different methods on hematopoietic stem cells separation. Three methods (Ficoll stratification, 6% hydroxyethyl starch natural sedimentation and 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation) are used to separate hematopoietic stem cells. The result showed more mononuclear cells were collected though 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation and least using Ficoll stratification. The following semisolid agar culture result pointed out CFU-GM colonies using 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation are significantly higher than that of the other two methods. Meanwhile, we also compared theCell phenotype of mononuclear cells collected from different methods and found more CD3+CD14+ and CD34+ were detected by the method of 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation. Overall, 6% hydroxyethyl starch density gradient centrifugation is an ideal separation method for mononuclear cells collecting. According to the published paper, many elements influence the mononuclear cells separation. In this paper, we chose three main factors, centrifugal temperature, centrifugal force and centrifugal time, and setup response surface method to find out the optimal factors co-ordinate. Finally, we find the combination of 15, 1000g and 17.8min could keep the cell viability reach up to 95.7%

 

In the last part, the effect of cell cryopreservation on the quality of mononuclear cells were analyzed. As we know, hematopoietic stem cell cryopreservation is the prime requirement for construction of umbilical cord blood bank and successful transplantation. Currently, two-steps slow cooling is the popular method which will influence cell viability remarkable with different cooling process. Three factors of cooling rate, cooling time and cooling terminal temperature were chosen to optimize the cooling process. According to the result of response surface method, under optimized conditions of 1.5/min (cooling rate), 40h (cooling time) and -80 (terminal temperature), cell viability after resuscitation could reach up to 98.7%. On the other hand, because of fast cooling, no ice crystal and less cell injury, vitrification has a good application prospect for preserving umbilical cord blood hematopoietic stem cells. According to the published paper, the types and dosage of antifreeze, the acceleration of freezing agents and the temperature of freezing agents are influence factors against cell activity. Though optimizing the three factors above, 17.1% of human serum albumin, -8.32 of drop temperature and 2.84%/min of drop acceleration were found out as optical condition. The cell viability after resuscitation could reach up to 99.1%.

 

Key words hematopoietic stem cells; Density gradient centrifugation; Mononuclear cell;Trypan blue method


 

 

  1 章  绪  论

1.1    造血干细胞概述

 

干细胞(stem cell)是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞,是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞,医学界称为万用细胞。干细胞研究被美国时代周刊列为 20 世纪世界十大科技进展之首。在形态上,干细胞具有很多共性,通常呈圆形或椭圆形,细胞体积小,约为 8μm,细胞核形状为圆形或肾形,具有两个核仁,细胞核多为常染色质,并具有较高的端粒酶活性。根据个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞,具有发育的全能性,能够分化为几乎全部组织和器官;成体干细胞是存在于成年动物的许多组织和器官,比如表皮和造血系统,具有修复和再生的能力的细胞,其只能分化成特定的细胞和组织,所以又被称之为组织特异性干细胞。然而近年来的研究表明,成体干细胞的分化潜能不止局限于此,已有研究表明造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化,肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化,即成体干细胞具有可塑性。这一发现为干细胞的应用开拓可更为广泛的空间。

 

造血干细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞,可定向分化、增殖为不同的血细胞系,并进一步生成各种血细胞,具有自我更新、多向分化和归巢(即定向迁移至造血组织器官)功能。人类造血干细胞首先出现于胚龄第 23 周的卵黄囊,在胚胎早期(第 23 月)迁至肝、脾,当孕妇怀孕达到五个月时,骨髓中的造血功能开始运转。在胚胎末期一直到出生后,骨髓成为造血干细胞存在的主要场所。因此,人类造血(血细胞生成)过程可分为胚胎造血和出生后骨髓造血过程。从这个角度来说,胚胎造血干细胞包括胎肝干细胞、脐带血干细胞和胎髓干细胞;出生后造血干细胞包括骨髓干细胞和外周血干细胞[1]。造血干细胞具有两个重要特征,高度的自我更新或自我复制能力;可分化成所有类型的血细胞。依据动力学模型进行分析[2],造血干细胞在增殖和分化的过程中发生不对称有丝分裂,也就是说一个干细胞分裂产生两个子细胞,其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性,从而保持身体内干细胞数量相对稳定,这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞,释放到外周血中,执行各自任务,直至衰老死亡,这一过程伴随着生命周期周而复始的进行。

 

在胚胎和迅速再生的骨髓中,大多数造血干细胞处于增殖周期之中;而在正常人体的骨髓中,任何时候,仅有约 5%的造血干细胞处于细胞周期的 S/G2/M 期,制造维持人体正常生命活动所需的血细胞,另外 20%处于 G1 期,其余 75%造血干细胞则处于在静止状态下的 G0 期(无 DNA 合成,无有丝分裂和细胞分裂)。研究发现,所有的造血干细胞总是处于一种动态的变化过程,它们不断的进入细胞周期,平均每 57 天,99%的造血干细胞都要分裂一次。因而,造血干细胞总是不停地进/出细胞周期,通常情况下处于不同时相的干细胞相对稳定,除非造血需求发生剧烈变动[3]。如当人体因大量失血需要大量造血,或因捐献造血干细胞而使工作中的骨髓造血干细胞数量减少时,处于休眠和备战状态的造血干细胞,会马上活跃起来参加造血活动。同时在损伤、炎症等应激状态下,造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。

 

按照分化水平,造血干细胞可分为多能干细胞(pleuripotent stem cell),定向干细胞(Committed stem cell)和成熟的子代细胞(如各类血细胞)。所以,造血干细胞是异质细胞群[4],是处于不同发育水平的等级状态下不单一的异质细胞群。造血干细胞可分化发育成不同血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多数处于增殖周期之中,并进一步分化为各系统的血细胞系,如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系。由造血干细胞分化出来的淋巴细胞系有两个发育途径,一个受胸腺的作用,在胸腺素的催化下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞,即 T 细胞;另一个不受胸腺,而受腔上囊(鸟类)或类囊器官(哺乳动物)的影响,分化成熟为囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞,即 B 细胞。T 细胞和 B 细胞再进一步引起细胞免疫及体液免疫。如果机体内造血干细胞缺陷,则可引起严重的免疫缺陷病。近年来研究发现,造血干细胞除分化产生髓系和淋巴系干、祖细胞外,还可以演变成与其组织发育或再生来源无关的细胞,即造血干细胞的可塑性[5-11],这为干细胞的应用开辟了更为广阔的前景。

 

长期以来,由于技术水平的限制,造血干细胞的功能只能在小鼠干细胞中进行,而对人类干细胞的研究只能通过间接方法进行。自 20 世纪 70 年代以来,随着科技不断进化发展,越来越多的新技术被应用在人类干细胞的研究中,人类干细胞的研究获得了长足的发展。如造血干细胞没有明确直接的形态学特征,都表现为淋巴细胞样的单个核母细胞,很难通过光学显微镜区分各种造血干细胞,这为造血干细胞的分离纯化并对其功能分析和分化的研究造成极大困难。而近年来随着单克隆抗体技术的进步,流式细胞仪(FACS)的应用以及对小鼠和人类造血干细胞表面标志的研究进展,为造血干细胞的分离纯化[12]及鉴定创造了条件。20 世纪 80 年代的研究发现 CD34 抗原在骨髓来源的干、祖细胞上高表达。应用 FACS 技术可分离纯化 CD34+ 细胞群,将该细胞群与造血因子共同体外培养可获得含有各种血细胞的混合集落,所以 CD34+的细胞群中是造血干细胞主要存在区域[13]CD34 抗原可视为骨髓造血干细胞表面分子标志之一[14]CD34 抗原是一种相对分子量为 115000 的磷酸糖蛋白,它的编码基因位于染色体 1 号长臂的 3 2 带(1q32),该基因的长度约为 26~28kb该基因含有 8 个外显子。进一步研究发现,从原始干细胞到定向祖细胞的不同分化阶段的造血干细胞细胞膜上均存在 CD34 抗原。Terstappen [15]CD34+细胞长期传代和分化培养后发现,在第一代干细胞膜表面表达的 CD34 抗原量最多,随着造血干细胞分化程度越高,CD34 抗原在细胞膜上的表达量呈现下降趋势。此外,根据细胞膜表面表达的其他抗原,还可以将异质性的 CD34+细胞分为不同的亚群。除 CD34 抗原之外,Try-1 是造血干细胞表面的又一抗原标志[16],其主要表达在早期造血干细胞表面,CD34+/Try-1+细胞约占 CD34+细胞群的 0.1%~0.5%,是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的造血干细胞。Try-1 抗原是细胞表面型糖蛋白连接分子,属免疫球蛋白超家族成员,与细胞间的黏附有关,介导细胞负增值信号,抑制早期细胞的增殖分化。由于 Try-1 抗原是造血干细胞表面的一早期标志,同样也用于对造血干细胞的筛选[17]

1.2    造血干细胞移植

 

1.2.1    定义

 

造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)指通过化学药物及放射治疗阻断原发疾病的发病过程,如杀灭体内的血液系统恶性肿瘤细胞、清除异常免疫细胞克隆等等,再将健康供体(自体或异体)的造血干细胞移植到患者体内,重建患者正常的造血系统及免疫系统,达到治疗目的的一种治疗手段。可见造血干细胞移植与骨髓移植并非同一概念。

 

根据细胞来源不同,造血干细胞移植可分为骨髓造血干细胞移植、外周血造血干细胞移植、脐带血造血干细胞移植。

 

1.2.2    移植的适应症

 

早期的造血干细胞移植主要适应症是各种原因的造血系统疾病,如造血系统肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等)和非恶性难治性血液病(重型再生障碍性贫血、地中海贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓纤维化等)的治疗,目前还被广泛应用于实体瘤(乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、成神经细胞瘤、小细胞肺癌等)以及某些遗传疾病(先天性免疫缺陷病)及重症自身免疫性疾病(系统性硬化症,重症肌无力,重症联合免疫缺陷症、严重自身免疫性疾病,系统性红斑狼疮等)的治疗,被誉为 20 世纪临床医学少数奇迹之一[18]。根据供体不同,造血干细胞移植可分为异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)和字体体造血干细胞移植(Auto-HSCT[19]。淋巴瘤、多发性骨髓瘤患者以及某些危险程度较低的急性白血病患者适合进行自体造血干细胞移植,危险程度中等或较高的急性白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、重型再生障碍性贫血、地中海贫血患者适合进行异基因造血干细胞移植。需要强调的是,对于很多造血干细胞异常引起的造血系统恶性肿瘤,虽然目前有很多先进的药物从遗传学水平治疗这些患者,但是异基因造血干细胞移植仍是治愈这些疾病的惟一治疗手段[20]

1.2.3    造血干细胞移植过程

 

1常规检查:通过移植前必要的体检和一些实验室检查对患者的全身状况进行评估,以确保后续移植的安全,并为将来的评估提供参照。检查项目包括眼睛(沙眼等)、口腔(龋齿等,须修补或拔除)、耳鼻喉科检查,普外科(痔疮、肛裂等),心脏、肺功能的检查,及骨穿、腰穿、胸部 X 线等。通过这些检查可以发现一些需要在移植前解决的潜在问题。

 

2签署同意书:同意书是一种法律文书,它确保医生必须告知患者一些移植过程中或移植后可能出现的危险及并发症。签署同意书前,医生会同患者或患者的家属进行一次深入的谈话。

 

3深静脉插管:在局部麻醉的状态下,在深静脉中插入一条比较细的柔软的导管,这样在今后的治疗中就可以通过静脉置管进行取血标本、输入药物等操作而不让患者产生痛苦。

 

4获取骨髓或干细胞:可从供体骨髓或外周血收集干细胞。如果是做自体移植,那么将对患者本人预先进行干细胞动员和采集。

5预先处理:预处理的定义通俗来讲就是在移植前需要对患者进行大剂量化疗和/或放疗。预处理的目的是从体内去除异常细胞,如肿瘤细胞。化疗的方式和剂量、以及是否需要行放疗等主要取决于患者自身的基础疾病和移植的种类。放疗和化疗可能会引起一些例如恶心,呕吐,腹泻,脱发,疲劳,厌食等等的不良反应。在同种异体移植的情况下,动员和收集供体骨髓或外周血干细胞的情况下,它与患者的移植预处理是同步进行的。

 

6移植:移植是一种非常简单的过程,要提前做好冻存或新鲜采集的(异体供者)的骨髓或外周血干细胞准备,然后迅速将准备好的材料经静脉输入患者体内。一旦这些干细胞成功地融入患者的外周血液,然后进入到骨髓内时,就会在他们之间产生大量的血细胞。

 

7植入:植入最早的表现为外周血白细胞的升高,在这一阶段内我们会经常对您的白细胞,尤其是中性粒细胞数量进行检测,以便观察植入的效果。外周血干细胞移植通常需要移植 2 周后进行,而移植后 2~4 周后进行骨髓移植,也会有部分患者更晚出现这个过程,当白细胞数量达到一定水平,患者就可以抵御感染和一些其它的并发症,并准备出院了。一般以移植的当天为 0 天,植入后的过程在临床上大致可以分为四期:初期(0~+3 天)假愈期(+4~+6 天)极期(+7~+14~+28天)恢复期(+20~+30 天以后)。初期因为大剂量的放、化疗的急性损伤,会有恶心、呕吐、腮腺肿痛等症状,这些症状在随后的假愈期中减轻或消失,但随着预处理的迟发效应,白细胞、血色素和血小板逐渐降低,就进入了极期,此时可能有感染发热、贫血、出血等症状,需要输血、静脉营养等支持,两三周的时间过去后,就可以恢复到正常的血象,患者就可以在全面恢复后办理出院,回家休养。

 

1.3     脐带血概述

 

1.3.1    脐带血研究的意义

 

脐带血是胎儿分娩后残留在胎盘和脐带间的血液,是没有受到任何辐射和污染的纯净血液。1974 Kundtzon 等首次发现人类脐带血中粒-单系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)产率远远高于成人外周血,紧接着,一些学者证明脐带血中造血细胞的质量和数量完全可与骨髓中的造血细胞媲美。在这些研究的基础上,20 世纪 80 年代末提出了用脐带血代替骨髓进行脐带血造血干细胞移植(umbilical cord blood

transplantation, UCBT )的设想并立题进行了临床研究。 1988 年, Broxmeyer

 

Gluckman [21]进行了世界首例脐带血造血干细胞移植,成功救治了一名范可尼贫血患儿。自此之后,脐带血的价值和作用才开始逐渐被人们认识。到目前为止,已有 25000 多例临床移植成功的案例,均取得较为满意的疗效[22]. 20 世纪 90 年代,研究发现,在脐带血血浆中存在丰富的造血生长因子,如白介素 1,3,6IL-1,3,6),红细胞生成素(Epo),粒细胞集落刺激因子(G-CSF),单核细胞集落刺激因子(M-CSF)等[23]。这些造血生长因子同样存在于骨髓和外周血中,这说明脐带血具有刺激造血的功能,进一步研究证实,脐带血中含有丰富的造血干细胞,单位体积内的含量比骨髓和外周血还高,而且造血干细胞比骨髓中的要更加原始。经过近些年的研究,脐带血造血干细胞移植技术逐渐得到全世界的认可,成为继骨髓和外周血后的第三大造血干细胞来源。

 

到目前为止,脐带血造血干细胞移植用于临床治疗已有 20 多年,相较于骨髓和外周血造血干细胞,脐带血造血干细胞采集更加方便,来源更加丰富,是一种重要的宝贵的生命资源。临床上,脐带血造血干细胞可用于治疗血液系统和免疫系统的多种疾病,包括血液系统恶性肿瘤和血红蛋白病、骨髓造血功能衰竭(如再生障碍性贫血)、先天性的代谢病和免疫缺陷病,自身免疫性疾病、一些实体瘤(如小细胞肺癌,神经母细胞瘤,卵巢癌)等 80 多种疾病。研究发现,自存脐带血在自体移植上有着更好的治疗效果。自存脐带血在自体使用时无需配型,随用随取。因为是自存自用并无排斥反应,治疗成功率高。同时一般自存脐带血会附送医疗保险,在赢得治疗时间的同时,还可减轻经济上的压力。

 

1.3.2    脐带血储存

 

1.3.2.1       脐带血储存的优势

 

1含有丰富的干细胞:脐带血内蕴含着数量巨大的丰富的造血干细胞,是造血干细胞最重要的三大来源之一,并且有很多渠道都可以获取脐带血,取血对于人体本

 

身没有任何不良影响。

 

2具有较高的安全性:脐带血有较低的病毒携带率,相较于骨髓来说,具备更高的安全性。

3具备更长的保存时间:随着细胞保藏技术的不断进步,脐带血造血干细胞能够在很长时间内保持存活状态,从而保证其在若干年后仍可应用于医疗服务中。

 

4移植后成活率高:造血干细胞通过移植进入人体之后会和机体产生一定的排斥反应,这是造成移植不成功的重要因素之一。与骨髓相比,脐带血造血干细胞移植所产生排斥反应要轻得多,所以移植后的成活率会有很大提高。

 

5取用时间不限:在收集、冷藏储存后,脐带血可以随时取用,不受时间限制,这在一定程度上缩短了骨髓或外周血造血干细胞移植所需的时长,不会耽误治疗时机。

1.3.2.2       脐带血储存流程

 

1脐带血采集

 

婴儿出生有顺产和剖腹产,所以脐带血的采集地点是在医院的产房或在手术室进行。由专业的医护人员进行脐带血采集,在胎儿出生后胎盘离开母亲之前,从与胎盘连接的脐带处收集脐带血,整个过程需要 1-2 分钟,不会影响胎儿的正常出生与母亲的产后休息。除了采集脐带血外,还会采集 6ml 母体外周血用于后续的检测。在采集工作结束之后,脐带血交由专职取血员在 24 小时内送往脐血库,在运送过程中取血员要实时监测取血箱的温度,使其始终保持在 4-25℃之间的安全温度,同时还要定期做温度保持的功能性测试,以保证脐带血的质量与安全性。

 

脐带血采集应尽可能收集足够多的血液样本,以保证较多的造血干细胞数量和后续的造血干细胞移植效果。通常情况下,脐血的采集分为两类:胎盘分娩前后。有文献报道,胎盘输送后收集的脐带血中有核细胞的数量低于胎盘输送前的数量[24]。所以,一般采用的方法是在胎盘娩出前进行采集,平均采集量为 93±22ml45~198 ml),平均采集到的有核细胞数为 11.2×108,整个采集的流程不会对母亲和新生儿产生任何影响。研究中大多将有核细胞数作为造血干细胞移植的指标。Broxmeyer[25]发现脐带血 T 移植成功所需的最低脐带血有核细胞计数应1×107/kg 受者体重。Gluckman[26]报道脐带血和标准骨髓移植相比,T 存活所需的有核细胞数量要更

 

低一个数量级。1998 Rubistein[27]报道指出,移植有核细胞数为 10×107/kg5~9.9 ×107/kg2.5~4.9×107/kg0.7~2.4×107/kg,移植成功率分别为 91%81%79%

 

74%;伦敦脐血库的标准为有核细胞数大于 3×108,平均有核细胞数为 1.02×109 2.5~40.8×108[28]。我们平均保存有核细胞数为 9.7×108±4.6×108。如果按照移植有核细胞数为 2×107/kg 标准计算,理论上每份脐血可满足体重50 kg 的个体使用。

 

2储存前制备

 

1) 信息验证和脐带血检测。采血者将脐带血袋和母亲的外周血送入血液采集室后,为确保脐带血库中每袋脐带血身份信息正确,工作人员将对存储的信息进行核查和验证,只有在相关信息完整的情况下收集的脐带血才可进行留档。同时还要检查血袋是否完整,脐带血血量是否达标(脐带血的入库标准要达到 50ml)等。如果所采集的脐带血的数量达不到要求的标准,那么会直接影响后期的临床应用。最后,只有脐带血各项信息符合入库标准后,工作人员才会对血袋进行唯一编码,以保证每份脐带血都是唯一的。

 

在收集到足够的脐带血血量后,工作人员将提取少许脐带血样本,并与母亲的血液样本一起进行一系列的安全检查,包括病毒核酸检测、无菌检测、造血干细胞数量及活力检测等。其中造血干细胞的活力检测,是模拟人体的环境对造血干细胞进行长达 14 天的增殖培养,检测其增殖活性与分化能力。

 

2) 细胞计数。造血干细胞属于有核细胞,因此,对有核细胞的计数可代表造血干细胞的数量。脐血库配备有五分类细胞计数仪,可对脐血中的有核细胞进行分类计数,只有在脐带血中有核细胞数合格的情况下才允许进入制剂室。

 

3) 制备分离。在脐带血制备过程中,对环境的要求相对较高。制备室需要配备有完全独立的风机空调系统,用以维持内部环境的洁净。其洁净度设计及管理要严格遵守国家 GMP 标准。制备室要求是万级无菌实验室,操作台应是百万级无菌操作台,要达到医院手术台的洁净程度。制备脐带血的过程分为分离,纯化及保留血液样本等步骤,这些过程的操作对成功的脐血冷冻保存起着至关重要的作用。制备流程是在全封闭的系统中进行的,在确保脐带血制备过程安全的前提下,需要提高有核细胞的回收率和保证分离效果的稳定性。脐带血中的红细胞和血浆等都会在离心过程中分层去除,最终留存富含造血干细胞的有核细胞成分。在制备完成后,要再次进行细胞计数,以评估制备效果和产品质量,如果不达标,说明制备失败,脐带血最终将不能入库。可见,脐带血储存的每个环节都需严格把关。

 

3冷冻保存

 

脐带血造血干细胞对于储存温度和储存环境的要求非常高,只有在冷冻保存的条件下,细胞才能保持休眠状态,细胞内的所有酶才会被抑制而不会造成电离损伤。为长久保存细胞活性需要对造血干细胞进行超低温冷冻。为了防止造血干细胞在冷冻过程中受损,在将处理后的脐带血样品进行液氮冷冻之前,应在样品中加入冷冻保存剂然后在进行冷却处理。在降温的过程中,需要利用专门的计算机程序逐步缓慢降低温度至-90℃后才可以转入-196℃超低温液氮中进行长期冻存,以保证干细胞活性不受影响。而对于脐带血的储存时间,从理论上讲,造血干细胞可以长期冻存,无时间限制。在冻存状态,造血干细胞活性和临床应用理论上不会受到影响。国外有一份冻存了 23.5 年的脐带血解冻复苏后,其活性仍保持正常。

1.3.2.3       脐带血储存费用

 

自上世纪 80 年代首例脐带血干细胞移植成功后,人们认识到脐带血具有巨大的潜在利用价值,为了更好地利用和研究脐带血干细胞,世界各地开始建设脐血库。 1993 年,美国纽约血液中心率先建立了世界上第一家脐血库[29]。随后许多国家纷纷建立了自己的脐血库,中国亦于 1996 年在北京建立了第一家脐血库[30]。为了更好地利用脐血库,依据权属关系的不同,可以将脐带血储存方式划分为两种类型:公共库和自体库。自体库则是为自己独有,需要自费承担脐血采集、保存等昂贵的费用,当然,他人无权使用。而公共库则是保存义务捐献的脐血,是可以供所有人使用的,但是捐赠者具有优先使用权。

 

脐带血储存的费用如下:20 年左右需要花费的费用大约在两万元,但是由于在不同地区计费方式不同,这个数据也只能作为一个参考。脐带血储存所需要的费用主要用与采集处理和保管。如有储存需求,在不同地区,可以向当地专业的脐带血保存机构咨询了解不同的脐血储存方式及其收费标准。有些地区会根据缴费方式(如:一次性缴费还是每年缴费)的不同给予一定的优惠。同时如果费用较高,也可办理免息分期付款。

 

1.4     脐带血干细胞

 

1.4.1 脐带血干细胞特征

 

脐带血中含有多种干细胞,如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞及无限制成体干细胞[31]. 间充质干细胞主要来源于骨髓和脐带血,其在脐带血中含量较少,但是增殖分化能力却比骨髓中的强[32]. 脐带血间充质干细胞可分化为脂细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝样细胞及脏壁中胚层等多种细胞,因此被认为是移植的最佳选择。在体外培养过程中,间充质干细胞表达 CD133CD34CD45SH234 以及 HOX 等蛋白,其中 HOX 被称为间充质干细胞的生物学指纹,因此被作为间充质干细胞分离的特异性标记物之一[33]。脐带血造血干细胞是脐带血中比例最高的一类干细胞,根据表面抗原,其又可分为 CD34+CD34-两种细胞亚群,其中CD34+细胞亚群占 95%以上[34]。在体外培养过程中造血干细胞具有较强的形成集落的能力,并表达大量的细胞因子,如各种集落刺激因子(CSFs),红细胞生成素(Epo),白介素 136IL-136)。这些细胞因子参与造血干细胞存活、自我更新、增殖、分化和迁移等一系列活动。脐带血内皮祖细胞大量存在于脐带血中并可在体外培养扩增,其在体外培养时会以集落单位的形式存在。内皮组细胞的主要功能是在血管重塑时参与新生血管的再生并定向分化为血管内皮细胞[35]。脐带血无限制成体干细胞是一类 CD45-/HLA-细胞,在脐带血中含量很少,其在体外培养时具有很强的增殖能力和多向分化能力,研究发现其向内胚层,中胚层和外胚层都能定向分化,具体可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂细胞及神经细胞[36]。 在体外培养过程中,这类细胞表达 CD13CD29CD44CD105 以及某些特殊标记,如 Runx1YB1 KDR [37]。研究认为,脐带血中间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞可能都是有脐带血中这种无限制成体干细胞发育而来。

 

1.4.2   脐带血干细胞分离工艺

 

脐带血造血干细胞移植是有效治疗白血病,再生障碍性贫血等疾病的方法之一。目前困扰脐带血造血干细胞移植的主要问题是单份脐带血所含造血干细胞数量少,利用脐带血干细胞具有的高增殖和体外扩增潜能,有可能解决单份脐带血中造血干细胞数量不足的限制。因此,探索一种有效的分离方法从而获得高纯度,最佳生长状态的脐带血造血干细胞用于体外扩增是保证治疗成功的关键因素。目前临床和科研中最常用的脐带血造血干细胞分离方法主要有以下三种:淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法(简称 Ficoll 法),6%羟乙基淀粉沉淀(HES)法和免疫磁珠(MACS)法。

 

1.4.2.1       Ficoll

 

Ficoll 法是一种单次密度梯度离心分离法,其原理是利用单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的体积、形态和密度与其他细胞不同而将其分离出来的方法。单个核细胞密度为 1.0751.090,介于红细胞和多核白细胞密度(为 1.090)和血小板密度(为 1.0301.035)之间。为此利用一种密度介于 1.0751.092 之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。

 

聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液,其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖(商品名为 Ficoll),分子量为 40kD,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的 Ficoll 溶液粘性高,易使细胞聚集,故通常使用 60g/L 的低浓度溶液,密度为 1.020,添加比重为 1.200 的泛影葡胺(urografin)以增加密度。分离人单个核细胞以密度为 1.077±0.001 的分层液最佳。分离时先将分层液置试管底层,然后将肝素化全血以 Hanks 液或 PBS 液作适当稀释后,轻轻叠加在分层液上面,使两者形成一个清晰的界面。离心后,离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到 Ficoll 而凝集成串钱状而沉积于管底,血小板则因密度小而悬浮于血浆中,而与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞后经洗涤离心重悬即可获得单个核细胞。本法分离单个核细胞纯度可达 95%,细胞获得率可达 80%以上。


 

 

1.4.2.2       6%羟乙基淀粉(HES)沉淀法

 

羟乙基淀粉(Hetastarch)是玉米或土豆中支链淀粉的葡萄糖环经羟乙基化形成的高分子复合物,其生理和化学特性主要由羟乙基取代级、平均分子量决定。该方法分离单个核细胞的原理是羟乙基淀粉能与红细胞膜上的负电荷结合,使红细胞形成缗钱状而下沉。该方法为全封闭操作,因而具有外源病原菌污染率低,分离效率高,操作简便,并且能使每份脐带血分离后终体积降到 20ml 左右等优点,非常适用于脐带血库分离脐带血造血干细胞[38]

 

将质量浓度为 60g/L 的羟乙基淀粉和脐带血按照 15 的比例混匀,4℃自然沉淀 1h 以上,小心吸取上层富含单个核细胞的悬液。将剩余部分再加入 9g/L 的盐水,再沉淀 1h 并吸取上层单个核细胞悬液,将两次收集的悬液 1000rpm 离心 5min,弃上清,加入适量红细胞裂解液,静置 10min 后,1000rpm 离心 5min,弃上清,L-DMEM洗两遍,即可得到脐带血单个核细胞。

 

1.4.2.3    免疫磁珠(MACS)法

 

免疫磁珠法分离细胞是包被一抗的与细胞表面抗原特异性结合,或包被二抗的磁珠与预先细胞表面抗原结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞被吸附于分离柱上,从而实现阳性细胞和阴性细胞的分离。该方法中的磁珠是人工合成的大小均匀的球形颗粒,内含氧化铁,外部包被一层多糖,直径仅为 50nm,体积与病毒相当。分选后的细胞可直接用于后续实验,磁珠可自行降解。

 

免疫磁珠分选策略可分为阳性分选,去除分选和复合分选。在阳性分选中,可直接将带有表面抗原的阳性细胞分选出来,该方法具有操作迅速简便,回收率高,纯度高等优点;去除分选策略可将带有非目的表面抗原的细胞从细胞混合物中去除,从而达到使目的细胞部分纯化的目的;复合分选则是联合上述两种分选策略,主要用于细胞亚群的分选或得到高纯度稀有细胞。

 

1.4.3    脐带血干细胞储存

 

1.4.3.1    脐带血造血干细胞的低温保存

 

脐带血造血干细胞移植对很多血液和免疫系统疾病均显示出令人满意的治疗效果,脐带血也因此成为造血干细胞移植的第三大来源。世界各国也相继开展了脐带血库的建立,而脐带血造血干细胞有效的储存方法是脐带血库建设的一个重要环节,同时也是临床移植成功的关键因素之一。

 

在冻融过程中,冰晶和渗漏是造成细胞损伤的两大重要因素。冰晶损伤是指细胞悬液在降温过程中,细胞内外的水分结冰所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡;渗漏损伤是指当细胞悬浮于溶液中时,随着温度降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使胞外溶液电解质浓度升高,如果细胞在这样高溶质的溶液中暴露时间过长,细胞膜上的脂质分子就会收到损坏,细胞发生渗漏,当细胞复温时,大量水分进入细胞,造成细胞死亡。

 

到目前为止,保护细胞免受损伤的有效方式是加入抗冻剂(Croprotective AgentsCPA),抗冻剂可分为渗透性和非渗透性两类[39]。渗透性抗冻剂是一些小分子物质,可以渗透到细胞内,如甘油、DMSO、甲醇、乙二醇,乙酰胺等。这类抗冻剂的保护机制是在细胞悬液凝固之前,渗透到细胞内,平衡细胞内外电解质的浓度,保护细胞免受渗透损伤,同时,防止胞内水分过度外渗,避免细胞过度脱水皱缩。非渗透性抗冻剂则是一些大分子物质,不能渗透到细胞内,如蔗糖、葡聚糖、羟乙基淀粉等。目前对该类抗冻剂的保护机制尚无定论,其中一种可能的机制是葡聚糖等大分子物质能优先与溶液中的水分子结合,降低自由水的含量,从而降低冰点,减少冰晶的形成,同时,由于其分子量大,使溶液中电解质浓度降低,从而减轻渗漏损伤。此外,研究发现,抗冻剂对细胞的保护效果还与冷冻速率、冷冻保存温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

 

根据冷冻速率不同,细胞低温保存方法主要分为两种。一种是慢速分步冷却法,利用各种温级的冰箱将加入抗冻剂的细胞悬液分阶段降温至-70~-80℃,然后直接投入-196℃(液氮)进行保存,或是利用计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液条件,以设定的降温速率将细胞悬液从室温降至<-100℃,然后再投入液氮中保存。以该种方法冻存的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。不同细胞的最适冷冻速率之间存在差异,如小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为-1.6/min

 

-70/min -200/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在-1.6~-300/min。有

 

文献报道 CD34+细胞的回收率随冷却温度的降低而下降,研究发现,CD34+细胞的最佳冻存条件为 10%DMSO,降温速率-1/min,此时 CD34+细胞回收率可达 93%±4%。当需要大规模冷冻保存时,可先将脐带血干细胞置于-802h,在直接放入液氮内即可。一种是超快速冷冻非晶态固化,又称玻璃化法,此时细胞内外形成的冰晶非常小或不结冰而呈现玻璃化,对细胞膜和细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。

 

冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞代谢变的极其缓慢甚至停止,然而复苏后细胞仍能保持正常的结构和功能。脐带血最佳的冷冻保存温度是-196℃(液氮保存),如果冷冻过程得当,在此温度下,细胞可保存十年以上;-70~-80℃只能用于短期冻存,随着冻存时间延长,细胞存活率明显下降;在0~-60℃则不适宜冻存细胞,因为在此温度区间,细胞内部产生的极微小冰晶会对细胞膜和细胞器产生损伤而导致细胞死亡。细胞复苏过程也会影响细胞存活率,一般来说,复苏过程越快越好。常规的做法是,在 37℃水浴中,于 1-2min 内完成复苏。如果过慢,细胞内往往重新形成冰晶而造成细胞损伤。复苏时冰晶对细胞造成的损伤非常快,往往在极短的时间内发生。

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