作者：admin 日期：2018-11-09 11:12:13 点击：607
神经胶质瘤是人体内最常见一种中枢系统神经肿瘤，发病率约占中枢神经系统的一半以上。依据其病理表现的不同，一般将其分为 4 个级别（Ⅰ～Ⅳ）。神经胶质瘤虽然在人体肿瘤总数发病率较低，但是其由于手术难以完全切除，术后易复发，导致其死亡率一直居高不下，目前对神经胶质瘤的诊断存在一些困难，目前传统的诊断方法依旧依赖手术取病理活检，手术过程中取病理组织经机器脱水浸蜡，包埋成蜡块进行切片、烤片，后经染色油镜下观察，进行诊断分期，取病理组织为有创操作，对患者损伤较大，对病理医师水平要求较高导致了神经胶质瘤诊断具有一定差异。由于取病里组织是一种有创检查，不仅会给患者带来痛苦，严重者会造成术后的出血从而导致颅内高压而危及患者生命，并且有的患者由于病情复杂也不能取病理组织活检。例如：患者有出血倾向，重度高血压，颅内感染等。代谢组学是通过对生物小分子代谢物定性和定量的分析，来揭示生物系统中错综复杂的生物调节机理。代谢产物是各种生理病理过程的最终产物，最能直接的反应机体的状态。神经胶质瘤的发生于发展与细胞内的代谢有着密不可分的关系，本实验的研究目的就是使用代谢组学的方法，采用液相色谱质谱（LC-MS）联用技术来对神经胶质瘤的恶性程度做出初步诊断，揭示这些代谢物与疾病发展中的联系，协助临床对神经胶质瘤恶性程度在不进行病理活检的前提下有一个初步的诊断，从而减轻患者经济和心理上的负担。此项研究是从代谢组学的角度来解释代谢物与神经胶质瘤恶性程度的关系。
与神经胶质瘤恶性程度有关的代谢物需要分别采用两种不同的衍生方法对样品进行样品衍生，分别使用不同的衍生试剂，本实验采用 AccQTagderivatization kits、 N-ethylmaleimide（NEM）分别对亚牛磺酸代谢通路及还原型谷胱甘肽进行衍生。亚牛磺酸代谢通路采用液相色谱质谱（LC-MS）联用技术对神经胶质瘤细胞（U251）分析：样品衍生采用 AccQTagderivatization kits，将低压冻干样品取出恢复至室温， 向冻干样品中加入 70μ L 的硼酸盐缓冲液，置于涡旋仪上涡旋 30s，再在向样品中 加入 20μ L 的衍生试剂，涡旋 10s，放入离心机 14000prm 离心 30s，取出后室温 放置 1 分钟后，放入电子恒温水浴箱中 55℃水浴衍生 10min。还原型谷胱甘肽的 检测采用液相色谱质谱（LC-MS）联用技术对神经胶质瘤细胞（U251）分析：首 先称取还原型谷胱甘肽 0.0061g 溶解在 1ml 50%甲醇水溶液中，再称取N-ethylmaleimide（NEM）0.030g 溶解在 1ml 50%甲醇水溶液中，将两者混合，置于涡旋仪上涡旋 30s，室温放置 45 分钟，衍生完毕后即可上机检测。
方法建立后我们要制作标准曲线，评估方法的日内、日间精密度及细胞内标回收率，日内精密度一般控制在 5%以内，但是不能超过 10%；日间精密度控制在15%即为合格。加标回收率考察的是前处理和上仪器测试全过程中待测物质的预处理情况（包括是否全部从样品中提取出来，是否在预处理过程中有损失或污染），以此来判断实验方法的可行性，加标回收率=加标后细胞标准物质量-加标前细胞标准物质量/加标物质量，加标回收率按照本实验室规定 90%-110%为合格。
验证数据显示该方法对 5 个 AQC 衍生化氨基酸具有良好的线性相关系数（0.9927~0.9997）；重复性 RSD 为 2.5%~8.6%；日内和日间精密度的 RSD 分别为3.41%~9.53%和 6.23%~9.23%；细胞加标回收率为 93%~106%。GSH 和 GSSH 相关系数分别为 0.9997 和 0.9869，日内精密 RSD 分别为 5.41%和 9.53%，日间精密度RSD 分别为 7.23%和 8.46%，加标回收率分别为 103%和 96%。
通过对本实验方法进行方法学评价，对实验方法线性回归分析、日内精密度及日间精密度，细胞内标回收率进行综合评估，本实验所建立起的实验方法能够对神经胶质瘤细胞（U251）代谢物种中还原性谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，亚牛磺酸、牛磺酸、胱氨酸、半胱氨酸、半胱胺亚磺酸进行绝对定量检测。
代谢组学可以为评估神经胶质瘤的恶性程度提供一种新的检测方法，通过测定细胞内相应代谢物含量的变化来对神经胶质瘤的恶性程度有一个初步的诊断。同时可以用于评估神经胶质瘤患者术后疗效，对预后有一个初期的判断，也可以为临床评估神经胶质瘤良恶性提供一个新的思路。
Objectives:Gliomas are the most common central nervous system tumors of the body, whose incidence accounting for more than half of the central nervous system tumors.According to different pathological manifestations, they are generally divided into four levels (Ⅰ ~ Ⅳ). Although the overall incidence of gliomas among human tumors is low, they still have a high mortality rate on account of difficulty to completely removing with surgery and easily postoperative recurrence.At present, it is difficult to diagnose gliomas. The traditional diagnostic methods currently still depend on the surgical biopsy. The pathological tissues from the operation are dehydrated and soaked in paraffin, sliced into slices of wax, sliced, and stained oil microscope observation, and the diagnosis of staging. Pathological tissues in the operation are from a invasive operation, which causes greater damages to patients, and at the same time different pathologist level leads to different diagnosis of gliomas.Because taking pathologicatissue in the operation is an invasive operation, not
only it does harm to patients,Severe cases can cause postoperative bleeding leading to intracranial hypertension and endanger the lives of patients, and some patients can not
take the pathological tissue biopsy due to the complexity of the disease.For example:
patients have bleeding tendency, severe hypertension, intracranialinfection.Metabolomics reveal the intricate mechanism of biological
regulation in biological systems, with the methods of the qualitative and quantitative analysis of metabolites of small biological molecules. Metabolites are the final products of a variety of physiological and pathological processes that most directly reflect the state of the human body. The occurrence of gliomas is closely related to the development of intracellular metabolism. The purpose of our study is to carry through preliminary diagnosis of the malignancy of the neoplasm and reveal the link between
the metabolites and the disease development and assist in the clinical diagnosis of glioma malignancy without the need for biopsy, and thereby reduce the patient's economic and psychological burdens with the methods of metabonomics and the combination of liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) .Our study is aiming atrelationship of metabolites and benign and malignant gliomas from the perspective of metabonomics.
Methods:Metabolites associated with the malignancy of gliomas require two different derivatization methods to derivative of the sample,respectively, using different derivatizing agents. In our experiment, AccQTagderivatization kits, N-ethylmaleimide (NEM) were used to derive the hypotaurine metabolic pathway and reduced glutathione. hypotaurine metabolic pathway Glioma cells(U251) were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS):Sample derivation depending on
AccQTagderivatization kits were used to remove the samples from lyophilization to room temperature and to the lyophilized samples 70μL of borate buffer, vortexed for 30s
on the vortexer, 20μL of derivatization reagent added to the sample, vortexed for 10s,
centrifuged at 14000prm centrifuge for 30s, taken out for 1 minute at room temperature, room temperature and to the lyophilized samples 70μL of borate buffer, vortexed for 30s
on the vortexer, 20μL of derivatization reagent added to the sample, vortexed for 10s,
centrifuged at 14000prm centrifuge for 30s, taken out for 1 minute at room temperature, and then placed Into an electronic water bath at 55 ℃ water bath derived 10min.
Detection of reduced glutathione Glioma cells (U251) were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS): First, 0.0061 g of reduced glutathione was dissolved in 1 ml of 50% aqueous methanol and weighed 0.030g of N-ethylmaleimide (NEM) was dissolved in 1ml of 50% aqueous solution of methanol, and the two were mixed and vortexed for 30s on a vortexer,Than 45 minutes at room temperature.
With the method established, we need to make a standard curve and evaluate the intraday and daytime precision as well as the intracellular standard recovery,Intraday precision generally controlled within 5%, but not more than 10%.The daytime precision
controlled at 15%.Spike recovery is the pretreatment and equipment testing the entire process of testing substances pretreatment conditions (Including whether all of them are extracted from the sample or whether they have been lost or contaminated during the pretreatment), in order to determine the feasibility of the experiment method. Spike recovery equals standard cell mass after spiking minus standard cell mass before spiking divided by spike mass, which is necessarybeween90% and 110% according to our laboratory requirements.
The validation data showed that the method had good linear correlation coefficient (0.9927~0.9997) for 5 AQC derivatized amino acids; reproducible RSD was 2.5%~8.6%; intraday and inter-day precision RSD were 3.41%~9.53% and 6.23% ~ 9.23%; Cell spike recovery rate of 93% ~ 106%. The correlation coefficients of GSH and GSSH were 0.9997 and 0.9869, respectively. The intraday precision RSD was 5.41% and 9.53%, and the intraday precision RSD was 7.23% and 8.46%, respectively. The spiked recoveries were 103% and 96%, respectively.
Results: Through the methodological evaluation of this experimental method,The linear regression analysis of experimental methods, intraday precision and daytime precision,
and a comprehensive assessment of intracellular standard recovery rate.Our experimental method can carry through absolute quantitative detection for reduced glutathione and oxidized glutathione , hypotaurine, taurine, cystine, cysteine, cysteaminesulfinic acid of glioma cells ( U251) metabolites.
Conclusion:
Metabonomics can provide a new method for assessing the malignant degree of gliomas. The preliminary diagnosis of glioma malignancy can be made by measuring the changes of the corresponding metabolites in the cells.At the same time, it can be used to evaluate the curative effect of patients with glioma and have an initial judgment on prognosis. It can also provide a new idea for clinical evaluation of benign and malignant gliomas.
Key words:Gliomas Metabolomics AccQTagderivatization kits N-ethylmaleimide Absolute quantification
前言
代谢组学（Metabonomics）是继蛋白组学（Protemics）、转录组学（Transcriptomics）和基因组学（Genomincs）之后新近发展起来的一门学科，是检测生物体系在受到 异常因素或异常信号干扰时，机体反应前后代谢组所表现出来的动态变化，是系 统生物学的一个重要分支，同时代谢组学也是基因组学、蛋白组学的一种表现形 式[1]。随着生物化学及分析化学的蓬勃发展，近年来代谢组学也应用出许多仪器分 析及技术平台，其中包括质谱、傅里叶转换仪、核磁共振波谱等，高精度、高灵 敏度现代仪器分析技术的发展也促进了代谢组学高速发展。其中气相色谱与质谱 联用（GC-MS），液相色谱与质谱联用（LC-MS），毛细管电泳技术比较常用。生 物体内所有小分子代谢物是代谢组学研究的主要对像，种类之庞大，包括：血液、 尿液、肠道菌群、细胞提取物、脑脊液、胸腹水等，通过对体液中代谢物成分的 动态监测来完成对疾病的诊断、进展及预后有一个综合的评估。另外，代谢组学 在植物功能基因研究的过程中应用最多，其次代谢组学还应用在疾病诊断[2]，差异 性代谢物的发现[3]、药物研发及药物毒理学[4]、食品及营养学也有一些应用。
本实验主要是对氨基酸及其氨基酸衍生物进行检测，氨基酸是生物体中最重要的代谢物之一。除了 20 种蛋白质氨基酸外，许多非蛋白质氨基酸在植物中也发挥重要作用。氨基酸的检测主要包括直接和间接的分析方法。通常在用茚三酮进行柱后衍生后分析氨基酸，其通量和特异性不足且灵敏度低[5]。通过使用 CE-MS 和HILIC-MS 的亲水相互作用，可以不需衍生化对氨基酸及其衍生物进行直接检测，但是 HILIC-MS 的柱效低和 CE-MS 重复性差是其应用的缺点。通过在流动相中添加离子对试剂可以提高 RP 色谱柱上氨基酸的保留率和氨基酸的电离效率[6]，但是阴离子对试剂会引起离子源污染，不适用于 MS 检测。另 一方面，梯度洗脱需要更长的平衡时间。由于衍生化方法的高稳定性，灵敏度和选择性，目前已被广泛用于氨基酸检测。通常使用异硫氰酸苯酯，邻苯二甲醛，氯甲酸 9-芴基甲酯，2,4-二硝基氟苯，6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）和丹磺酰氯作为衍生试剂[7]。 AQC 衍生化衍生时间短，副反应少，稳定性好，毒性低，衍生化程序简单，目前已近广泛应用在氨基酸的检测当中[8]。几年前开发了紫外检测衍生化的氨基酸分析方法，并已经成功应用于高效液相色谱（HPLC），高效液相色谱法（AccQ-Tag）沃特世公司的高效液相色谱（UPLC）。然而，使用紫外检测，定量准确性受到基质中洗脱化合物的影响。到目前为止，还没有使用 UPLC 偶联单个四极杆质谱检测器（SQD）和多反应监测模式（MRM）检测氨基酸测定的 AQC衍生化对氨基酸进行绝对定量的研究。
神经胶质瘤是人体内最常见一种中枢系统神经肿瘤，发病率约占中枢神经系统的一半以上。依据其病理表现的不同，一般将其分为 4 个级别（Ⅰ～Ⅳ）。神经胶质瘤虽然在人体肿瘤总数发病率较低，但是其由于手术难以完全切除，术后易复发，导致死亡率一直居高不下，以多形性胶母细胞瘤（Ⅳ）为例，术后辅助放化疗患者其生存中位数约在15 个月左右[9]，而生存能够超过2 年的患者仅仅占15%[10]。目前已经有研究表明，神经胶质瘤组织内亚牛磺酸的含量与胶质瘤细胞的生长成 正相关，哺乳动物体内现已发现两条亚牛磺酸合成途径：（1）胱氨酸分解成半胱 氨酸后经半胱氨酸加双氧酶（CDO）转化成半胱亚磺酸，再经脱羧酶（CSAD）作 用生成亚牛磺酸；（2）半胱氨酸与辅酶 A 结合，产生半胱胺，后者经半胱胺加 双氧酶（ADO）催化生成亚牛磺酸，亚牛磺酸最终可氧化成牛磺酸[11]，有人使用 亚牛磺酸合成受损的神经胶质瘤细胞（U251）研究细胞生长特性，同型半胱氨酸（HCA）抑制半胱氨酸亚磺酸脱羧酶的活性，从而抑制亚牛磺酸的产生，研究表明，HCA 可以抑制 U251 细胞的生长，与胞内亚牛磺酸水平降低相一致[12]。目前亚牛磺酸合成途径代谢物的检测方法只有相对定量，只能反映神经胶质瘤细胞内亚牛磺酸的相对含量[13]，目前尚缺少一种方法能够客观的反映出神经胶质瘤细胞中亚牛磺酸的含量，本实验的主要目的就是建立一种能对神经胶质瘤细胞中亚牛磺酸及其代谢通路上代谢物进行绝对定量的一种检测方法。
谷胱甘肽（γ -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）是一种内源抗氧化剂，在抗氧化损伤的细胞防御中发挥重要作用。它几乎存在于所有的哺乳动物组织中，并且存在游离形式或与蛋白质或者其他内源性和外源性化合物缀合的结合形式。游离谷胱甘肽主要以还原型（GSH）存在，在自由基积累的条件下易被氧化为二硫化谷胱甘肽即氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSSG 本身是一个稳定的分子，需要谷胱甘肽还原酶的作用来还原生成 GSH。因此，氧化应激导致 GSH 水平降低，进而易于增加对氧化损伤的敏感性，这是一种被认为会导致各种疾病状态的周期。GSH 以 1 至10mM 的浓度存在于组织中，由于其能够提供还原当量，对于有毒活性物质可以直接或者间接的中和，特别是针对细胞氧化应激损伤[14]，从而对人体具有保护作用。氧化应激可以对组织细胞造成不可逆的损伤，涉及神经胶质瘤发生发展的主要原因是遗传和活性氧（ROS）形成，从而导致的细胞损伤引起基因失调。 ROS 的过度产生在神经胶质瘤中已经涉及 DNA 甲基化的失调，核小体重排和组蛋白的乙酰化的表观遗传异常[15]。目前已经有一些疾病将 GSH 和 GSSH 或 GSH / GSSG 比率的降低已被用作氧化应激和疾病风险的指标[16]。使用 GSH 和GSSG 或GSH / GSSG 作为氧化应激的生物标志物已经衍生出许多在生物样品中测量这些化合物的方法，利如紫外（UV）吸光度，荧光，电化学和液相色谱-质谱（LC-MS）进行分离，GSH 和 GSSG 检测的浓度差别很大，尤其是 GSSG 水平，在样品处理过程中样品容易被氧化，如果实验条件没有得到适当的控制，可能会出现假性升高[17.18.19]。为了解决对 GSH 和 GSSG 测定方法的需求，本实验建立了一种一步衍生化程序使分析前 GSH 的人为氧化差异性最小化，优化色谱，以消除离子抑制，并提高精度和灵敏度，即使待测样品中谷胱甘肽含量极低，我们所建立的方法也能够满足检测需要。
目前临床诊断神经胶质瘤依旧依赖手术取病理活检、影像学及分子生物学标记物，手术过程中取病理组织经机器脱水浸蜡，包埋成蜡块进行切片、烤片，后经染色油镜下观察，进行诊断分期。染色方法目前采用苏木素-伊红（HE）染色，目前HE染色广泛应用在病理学、胚胎学中，是目前使用最广泛的一种技术方法。取病理组织为有创操作，对患者损伤较大，对病理医师水平要求较高导致了神经胶质瘤诊断具有一定差异。影像学CT平扫难以确定肿瘤边界，增强CT可以显示部分胶质瘤强化边界，MRI增强后T1强化仅代表血脑屏障破坏的边界，不代表胶质瘤浸润的真实边界。上述表现均非特异性，须结合生物学标志物加以鉴别。IDH1、
GFAP、P53由于基因突变及过表达或低表达成为神经胶质相对特异性标志物，对于辅助诊断起到重要作用。由于人体具有血脑屏障，大分子蛋白、氨基酸不能通过血脑屏障，固而代谢组学则可以通过检测脑脊液中的相关代谢物水平含量来对胶质瘤有一个初步诊断。
一、仪器：
1. LCMS-8050 Triple quadrupole 日本岛津公司
2. LC-MS 液相色谱：ACQUITY Ultra Performance LC 质谱：QExactive H
3. 高速冷冻离心机：美国 Thermo Scientific 公司
4. 真空低温离心浓缩仪：美国 Labconco 公司
5.-80℃冰箱：美国 Thermo Scientific 公司
6. 电热恒温水浴箱：中国北京市广明医疗器械公司
7. 电子天平：瑞士 Mettler Toledo 公司
8. 涡旋仪：德国 IKA 公司
9. 离心管、移液枪、EP 管：Eppendorf 公司
10. 纯水仪：法国超纯水系统 Milli-Q Advantage A10
二、耗材
1. 甲醇、乙醇、乙腈：德国默克（Merck）股份有限公司（色谱纯）
2. 甲酸铵（≥98%）：国药集团化学试剂有限公司
3. 甲酸（≥98%）、乙酸（≥99%）：北京百灵威科技有限公司
4. 还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽：购买于 Sigma ALDRICH 公司（日本）
5. 牛磺酸、亚牛磺酸：Sigma ALDRICH 公司（日本）
6. 胱氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司
7. 半胱氨酸：北京百灵威科技有限公司
8. 半胱胺亚磺酸：上海伟寰生物科技有限公司
9. 抗坏血酸： SIGMA（中国）有限公司
10.N-ethylmaleimide ：购买于武汉启动子生物有限公司
11.6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl：AccQTagderivatization kitsWaters（美国） 12.DMEM, Phosphate Buffered Saline: HyClone（美国）
13.0.25% Trypsin-EDTA，双抗：gibco Thermo Fisher（中国）实验步骤：
1. 细胞培养
将神经胶质瘤细胞（U251），细胞购买于上海纪宁实业有限公司，接种在 15cm
培养皿中，加入 20ml 完全培养基（DMEM 培养基，5%小牛血清，1%双抗），置于 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，细胞培养后用于代谢物提取。
2. 样本预处理
2.1 细胞样本预处理
将培养好的细胞放置在冰盒上，从而降低细胞代谢来尽可能减少细胞内代谢物的改变，先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞 3 遍，然后加入 1ml 生理盐水，用细胞铲将细胞刮下来，收集到 15ml 离心管中，加入 2ml 体积比为 20:80 的甲醇水溶液，置于涡旋仪上充分震荡 2 分钟后，置入离心机中 14000prm 离心 15min，取上清液各 600μ L，一份用于还原型谷胱甘肽衍生，另一份置入真空低温离心浓缩仪中冻干用于亚牛磺酸代谢通路代谢物衍生。
2.2 标准样品的配置
用电子天平分别称取亚牛磺酸，牛磺酸，半胱胺亚磺酸，还原型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽各 1mg，加入 1ml 体积比为 20：80 的甲醇水溶液中，配置成浓度为1mg/ml 的母液。胱氨酸、半胱氨酸不易溶于水及有机溶液，称取 1mg 胱氨酸、半胱氨酸加入 0.9ml 体积比为 20：80 的甲醇水再加入 0.1ml 的盐酸即可溶解，配置成 1mg/ml 母液。
3. 样本的衍生
3.1 亚牛磺酸代谢通路标准样品衍生
本次衍生采用 AccQTagderivatization kits，将低压冻干样品取出恢复至室温，向冻干样品中加入 70μ L 的硼酸盐缓冲液，置于涡旋仪上涡旋 30s，再在向样品中加入 20μ L 的衍生试剂，涡旋 10s，放入离心机 14000prm 离心 30s，取出后室温放置 1 分钟后，放入电子恒温水浴箱中 55℃水浴衍生 10min。
3.2 还原型谷胱甘肽标准样品衍生
由于还原型谷胱甘肽容易发生氧化，所以，还原型谷胱甘肽标准溶液需要现用现配。首先称取还原型谷胱甘肽 0.0061g 溶解在 1ml 50%甲醇水溶液中，再称取 N-ethylmaleimide（NEM）0.030g 溶解在 1ml 50%甲醇水溶液中，将两者混合，置于涡旋仪上涡旋 30s，室温放置 45 分钟，衍生完毕后即可上机检测。
4. 液质联用分析条件：
4.1 亚牛磺酸代谢通路仪器及实验条件： 实验仪器：LCMS-8050 Triple quadrupol
4.1.1 液相分离条件：
4.1.1.1 液相色谱柱：ACQUITY UPLC C18（2.1×100mm 1.7μ m）
4.1.1.2 液相条件：A 相：5mM 甲酸铵 0.5%甲酸水溶液
B 相:纯乙腈
4.1.1.3 液相色谱洗脱梯度：B 相 0-1min，5%；1-20min，25%；20-25min，57%；
25-27min，99%；27.0-27.5min，5%；27.5-30.0min，STOP。流速 0.25 mL/min，进样体积：1μ L，色谱柱温度：50℃。
4.1.2 质谱检测条件：
4.1.2.1 离子源 ESI：positive
雾化气体流速（Nebulizing Gas Flow）：1L/min，加热气体流速（Heating GasFlow）：10L/min，离子源表面温度（Interface Temperature）：300℃，加热模块温度（Heat Block Temperature）：400℃，干燥气体流速（Drying Gas Flow）：10L/min。
4.1.2.2 压力泵及色谱柱
泵的压力上限设定为 100Mpa，仪器运行时泵的压力维持在 35-50Mpa 之间，色谱柱温度上限设定为 85℃。
4.1.2.3 采集模式：多反应监测模式(MRM)
在正离子模式下对亚牛磺酸代谢途径进行检测，采用多反应监测模式(MRM)。碰撞能分别为10V 半胱氨酸(292→171)；6V 亚牛磺酸(280→171)；6V 牛磺酸(296→171) )；10V 胱氨酸(581→171)；0V 半胱胺亚磺酸(324→171)。
4.2 谷胱甘肽仪器及实验条件：
实验仪器：液相色谱：ACQUITYUltra Performance LC 质谱：QExactive HF
4.2.1 液相分离条件：
4.2.1.1 液相色谱柱：Discovery HS F5-3（2.1mmI.D.×150mmL，3μ m）液相条件：A 相：0.1%乙酸水溶液
B 相：0.1%乙酸乙腈溶液
4.2.1.2 洗脱梯度：A 相 0-1.4min，100%；1.4-3.5min，75%；3.5-7.5min，65%；
7.5-10.3min，5%；10.3-13.7min，5%；13.7-13.8min，100%；13.8-17min，100%。流速为 0.35mL/min，进样体积：1μ L，色谱柱温度：40℃。
4.2.2 质谱检测条件：
4.2.2.1 离子源 ESI：positive；General：Runtime：0 to 17 min； Inclusion：On；分辨率：120000；扫描范围：100 to700m/z。
4.2.2.2 dd-MS2/dd-SIM:分辨率：30000;AGC Target 1e5；Isolation window：1.0m/z；
（N）CE/、/stepped:nice：15,30,45.
4.2.2.3 采集模式：Full Scan
在正离子模式下对 GSH-NEM m/z：433.13831，GSSH m/z：613.15924 进行检测。
5. 标准曲线的制作
所谓标准曲线是指标准物质的化学物理属性跟仪器响应之间的函数关系，建立标准去曲线的目的是指导待测物质的理化属性。常用标准曲线进行定量分析，通常情况下，标准曲线是一条直线。将我们已经配置好氨基酸标准品母液，衍生后稀释成 2.5ng/ml；5ng/ml；10ng/ml；50ng/ml；100ng/ml；500ng/ml；10000ng/ml； 50000ng/ml 8 个浓度梯度，移置进样瓶中，送至仪器检测，进样时应注意应从低浓度从高浓度检测，以防检测完高浓度样品时，色谱柱冲洗不彻底，造成低浓度样品掩盖效应，而出现假阳性结果。
6. 日内精密度及日间精密度
精密度是表示测量的再现性，是保证准确度的前提条件，但是高的精密度不一定保证有高的准确度。良好的精密度是保证获得准确度的先决条件之一。一般说来，测量精密度越低，测量所得的准确度就越低。我们统一使用衍生后标准液浓度为 1000ng/ml 做精密度，测量日内精密度时，我们将 1000ng/ml 的标准也重复进样 10 次。日内精密度时，我们在每天的同一时间对同一样本进行检查，连续检测3 天，每天重复 6 次。评估精密度我们使用相对标准偏差（RSD），计算公式相对标准偏差（RSD）：标准偏差（SD）/平均值（X）。我们使用 EXCEL2015 版计算RSD，首先我们要计算出 SD，单元格内输入=STDEV 即是我们的 SD，计算出平均值 X，即 RSD=STDEV/X。日内精密度一般控制在 5%以内，但是不能超过 10%；日间精密度控制在 15%即为合格。
7. 细胞内标回收率
细胞内标回收率指的就是加标回收率，是指在没有待测物质的空白样品中加入定量的标准物质，按样本的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。加标回收率考察的是前处理和上仪器测试全过程中待测物质的前处理情况（包括是否全部从样品中提取出来，是否在前处理过程中有损失或污染），以此来判断实验方法的可行性。本实验考察的是样本前处理的加标回收率=加标后细胞标准物质量加标前细胞标准物质量/加标物质量，加标回收率按照本实验室规定 90%-110%为合格。
8. 数据处理
本实验使用两种仪器，数据处理时需使用两种组学处理软件。亚牛磺酸代谢通路检测我们使用的是 LCMS-8050 Triple quadrupol 仪器控制软件，在仪器工作站LabSolutions 的 Postrun 下打开 Browser，打开我们编辑好的数据处理方法：反应监测模式(MRM)。碰撞能分别为 10V 半胱氨酸(292→171) 保留时间：4.275min。；
6V 亚牛磺酸(280→171) 保留时间：1.324min。；6V 牛磺酸(296→171) 保留时间：1.32min。；10V 胱氨酸(581→171) 保留时间：6.551min。；0V 半胱胺亚磺酸(324→171) 保留时间：1.261min。手动积峰，将相应氨基酸的峰面积导成 EXCEL 格式输出，用于做线性回归方程、日内精密度及日间精密度、细胞回收率。还原型谷胱甘肽数据处理我们使用 XcaliburQual Browser 浏览我们的数据结果，直接提取衍生化后还原型谷胱甘肽（GSH-NEM）m/z：433.13831，保留时间：4.63min；氧化型谷胱甘肽（GSSH）m/z：613.15924，保留时间：3.79min。峰面积导成 EXCEL表格，用来制作线性回归方程、日内精密度及日间精密度、细胞回收率。
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