天天硕士研究生论文网

硕士论文范文

生命早期铅暴露对小鼠脑组织自噬因子的影响

作者:admin 日期:2018-10-26 10:55:28 点击:548

摘要 

目的

通过建立小鼠幼年铅暴露时间序列及白藜芦醇干预模型,以 AMPK/mTOR作为自噬通路研究起点,探索生命早期铅暴露对小鼠脑组织自噬发展及 BACE1、 p-Tau 蛋白表达量改变的影响。

方法

建立小鼠铅暴露时间序列模型,即 4 周龄雄性 C57BL/6 小鼠随机分为 6组,实验组以自由饮水方式进行 0.2%的醋酸铅溶液染毒 3 个月后饲养至不同生命节点(4 月龄-4Pb、13 月龄-13Pb 及 16 月龄-16Pb);同龄对照组仅饮用去离子水(4 月龄-4C、13 月龄-13C 及 16 月龄-16C)。同时,建立小鼠白藜芦醇(resveratrol,Res)干预模型,4 周龄雄性 C57BL/6 小鼠饮水染铅 3 个月后,进行 12 个月 Res 隔天灌胃,分为对照组(Cont),染铅组(Pb),染铅后 Res干预组(PbR)和 Res 组(CR)。

对小鼠断头后剥离脑组织,分离皮层及海马区,并进行组织蛋白及 mRNA提取。采用 Western blotting 检测自噬通路因子中自噬诱导因子(AMPK、mTOR、Rictor、GβL)、自噬体成熟辅助因子(Beclin-1、Atg12、Atg3、Atg7)、自噬降解标志因子(LC3-II/I、p62)、学习记忆损伤相关因子(p-Tau、 BACE1)的相对表达;Real-time PCR 检测 AMPK、mTOR、Beclin-1、Atg12、LC3a、BACE1 等基因的 mRNA 表达水平。

结果

1. 小鼠海马及皮层组织铅暴露时间序列中蛋白表达变化趋势:染铅组小鼠 p-AMPK/AMPK 蛋白相对比低于同龄对照组可见于海马 4 月龄和 13 月龄(P<0.001)及 16  月龄(P<0.01)、皮层 13  月龄及 16  月龄(P<0.001);染铅组小鼠 p-mTOR/mTOR 蛋白相对比低于同龄对照组可见于海马 13 月龄及 16 月龄(P<0.001)、皮层 13 月龄及 16 月龄(P<0.05 及 P<0.01)。染铅组小鼠 Beclin-1 蛋白表达量高于对照组可见于海马及皮层各年龄组(P<0.05 及 P<0.001);Atg12蛋白表达量染铅组高于对照组可见于海马各年龄组(P<0.05)及皮层 13 月龄、16 月龄(P<0.001)。LC3II/LC3I 蛋白相对比染铅组高于对照组可见于海马各年龄组(P<0.05);p62 蛋白表达量染铅组高于对照组可见于海马 13 月龄及 16 月龄(P<0.05)及皮层 4 月龄、16 月龄(P<0.05)。BACE1 蛋白相对表达量染铅组高于对照组可见于海马 13 月龄及 16 月龄(P<0.001 及 P<0.01)及皮层 13 月龄、16 月龄(P<0.01、P<0.001);p-Tau 蛋白表达量染铅组高于对照组可见于海马 13 月龄及 16 月龄(P<0.001)、皮层 4 月龄及 13 月龄(P<0.05)。

2. 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠中海马及皮层组织自噬调节因子及 BACE1、p-Tau蛋白表达的影响:与 Pb 组相比,PbR 组小鼠皮层区 p-AMPK/AMPK  蛋白相对比降低(P<0.05);与 Pb 组相比,PbR 组小鼠海马区中 Beclin-1、BACE1、p-Tau蛋白表达量明显降低(P<0.05、P<0.001、P<0.05),PbR 组小鼠皮层区中 Beclin-1、BACE1、p-Tau 蛋白表达量明显降低(P<0.001、P<0.001、P<0.05)。与 Pb 组 相比,PbR 组小鼠海马及皮层区中p62 蛋白表达量明显降低(P<0.001 及P<0.05)。

3. 小鼠海马及皮层铅暴露时间序列中 mRNA 表达变化趋势:染铅组表达量低于对照组可见于 16 月龄小鼠海马及皮层的 AMPK mRNA(P<0.05)、皮层 13 月龄及 16 月龄小鼠皮层区的 mTOR mRNA(P<0.05);染铅组高于对照组可见于 13月龄小鼠海马区的 Beclin-1  mRNA(P<0.001)、4 月龄和 13 月龄小鼠海马及 13月龄组小鼠皮层区的 Atg12 mRNA(P<0.05 和 P<0.01 及 P<0.05)、16 月龄小鼠海马及皮层区的 LC3a  mRNA(P<0.05)、各月龄小鼠海马区的 BACE1  mRNA(P<0.05)。

4. 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠中海马及皮层组织自噬调节因子及 BACE1mRNA 表达的影响:与 Pb 组相比, PbR 组小鼠海马区的 Beclin-1、LC3a mRNA降低(P<0.05)。与 Pb 组相比, PbR 组小鼠皮层区的 AMPK  mRNA 明显升高(P<0.001); PbR 组小鼠皮层区 Atg12、LC3a mRNA 减少(P<0.01)。

结论

1. 生命早期铅暴露可促进老龄小鼠脑组织中自噬起始及形成相关因子的表达、抑制自噬降解底物蛋白 p62 水平,并上调 BACE1、p-Tau 蛋白表达,提示铅暴露可诱导小鼠脑组织自噬体成熟、抑制神经元自噬降解,引起自噬体滞留及神经功能损伤。

2. 白藜芦醇干预可通过抑制神经元内自噬体形成、促进自噬降解,同时下调BACE1、p-Tau 蛋白表达,进而发挥神经保护作用。

关键词

代写医学硕士论文价格 铅 自噬 单磷酸腺苷活化蛋白激酶 Beclin-1 微管相关蛋白 1 轻链 3

Abstract

 

Objective

In the present study, we established the early-life lead (Pb) exposure time series mice model, and antioxidant resveratrol was also employed as an intervention agent. Furthermore, AMPK/mTOR was chosen as the starting point for the study of autophagy pathway. In the view of our previous study, we focused on exploring the effect of lead exposure on the development of neuronal autophagy and the changes of protein expression of BACE1 and p-Tau.

Methods

First, time series model of mouse lead(Pb) exposure was established as follows. After three months of lead exposure in 4-week-old C57BL/6 mice, they were allowed to freely drink deionized water to different life periods (4 months old was tagged as 4Pb, 13 months old--13Pb and 16 months old--16Pb); The control group used weaning C57BL/6 mice to freely drink deionized water for three months and continued to drink deionized water to different life periods (4 months of age--4C, 13 months of age--13C and 16 months of age--16C). In addition, resveratrol intervention mice model was established. Male weaning C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: control group (C), lead exposure group (Pb), resveratrol control group (CR), and resveratrol intervention group (PbR).

After the mice were decapitated, the brain tissue was dissected, especially the cortex and hippocampus parts, and tissue protein and mRNA were extracted. Western blotting was used to detect autophagy pathway factors: autophagy inducing factors(AMPK, mTOR, Rictor, GβL), autophagosome maturation cofactors(Beclin-1, Atg12, Atg3,Atg7), autophagy degradation markers(LC3-II/I, p62), and learning and memory impairment markers(p-Tau and BACE1). Real-time PCR was used to detect the mRNA levels expression of AMPK, mTOR, Beclin-1, Atg12, LC3a and BACE1.

Results

1. Trends of brain protein expression levels involving certain age nodes of mice following early-life exposure to Pb: the ratio of p-AMPK/AMPK in Pb-exposed group was less than that in the age-matched control group, which was found in hippocampus at age of 4 months, 13 months(P<0.001) and 16 months(P<0.01) and in cortex at age of 13 month and 16 month(P<0.001); the ratio of p-mTOR/mTOR protein in the Pb- exposed group was less than that in the age-matched control group, which was found in hippocampus at age of 13 months and 16 months(P<0.001) and in cortex at age of 13 month and 16 month(P<0.05 and P<0.01). The level of Beclin-1 protein in the Pb- exposed group was higher than that in the matched control group, which was found in hippocampus and cortex of each age-matched group (P<0.05 and P<0.001). The level of Atg12 protein in the Pb-exposed group was higher than the control group, which was found in the hippocampus in all age-matched groups (P<0.05) and in the cortex at 13 months and 16 months(P<0.001). The ratio of LC3II/LC3I protein in the Pb-exposed group was higher than that in the control group, which was found in all the hippocampal age-matched groups(P<0.05). The level of p62 protein in the Pb-exposed group was higher than the control group, which was found in the hippocampus at 13 months and 16 months(P<0.05) and in the cortex at 4 months and 16 months (P<0.05). The level of BACE1 protein in the Pb-exposed group was higher than the control group, which was found in hippocampus at 13 months and 16 months (P<0.001 and P<0.01)and in the cortex at 13 months and 16 months (P<0.01 and P<0.001); the level of p-Tau protein in the Pb-exposed was higher than the control group, which was found in the hippocampus at 13 months and 16 months (P<0.001), and in the cortex at 4 months and13 months(P<0.05).

2. The effect of resveratrol on protein levels of autophagic intermediaters as well as BACE1 and p-Tau: The ratio of cortex p-AMPK/AMPK protein in Pb group was lower than that in PbR group(P<0.05); the results showed that the protein levels of Beclin-1, BACE1, p-Tau in PbR group were significantly decreased compared with Pb group, which occurred in both hippocampus (P<0.05, P<0.001and P<0.05 respectively) and cortex(P<0.001, P<0.001 and P<0.05 respectively). What’s more, the level of p62 protein in PbR group was significantly down-regulated compared with Pb group, which was found in both hippocampus and cortex of mice (P<0.001 and P<0.05).

3. Trends of brain mRNA expression involving certain age nodes of mice following early-life exposure to Pb: The level of AMPK mRNA in Pb-exposed group was lower than that in the age-matched control group, which was found in both hippocampus and cortex at 16 months (P<0.05); the level of mTOR mRNA in Pb-exposed group was lower than that in the age-matched control group, which was found in cortex at 13 months and 16 months (P<0.05). The level of Beclin-1 mRNA in Pb-exposed group was higher than that in the age-matched control group, which was found in hippocampus at 13 months (P<0.001); the level of Atg12 mRNA in Pb-exposed group was higher than that in the age-matched control group, which was found in hippocampus at 4 and 13 months (P<0.05 and P<0.01), and in cortex at 13 months (P<0.05). The level of LC3a mRNA in Pb-exposed group was higher than that in the age-matched control group, which was found in both hippocampus and cortex at 16 months (P<0.05). The level of BACE1 mRNA in Pb-exposed group was higher than that in the age-matched control group, which was found in all hippocampal age nodes (P<0.05).

4. The effect of resveratrol on mRNA expression of autophagic intermediaters: The

level of cortex AMPK mRNA in Pb group was lower than that in PbR group(P<0.001);

the results showed that the mRNA levels of both Beclin-1and LC3a in PbR group were significantly decreased compared with Pb group, which occurred in hippocampus (both P<0.05). What’s more, the level of Atg12 and LC3a mRNA in PbR group was significantly down-regulated compared with Pb group, which was found in cortex of mice (P<0.01).

Conclusions

 

autophagosomes and neuronal damage.


protective role of resveratrol in response to Pb.

Key words

Lead(Pb) Autophagy AMPK Beclin-1 LC3


目录

摘 要 I

Abstract IV

图 表 索 引 XI

缩 略 词 表 XIV

1 引 言 1

2 材 料 与 方 法 6

2.1 实 验 材 料 6

2.1.1 实 验 动 物 6

2.1.2 主 要 试 剂 与 耗 材 6

2.1.3 主 要 试 剂 及 其 配 制 8

2.1.4 主 要 仪 器 与 设 备 11

2.2 实 验 方 法 12

2.2.1 动 物 饲 养 及 分 组 12

2.2.2 小 鼠 脑 组 织 采 集 13

2.2.3 Real-time PCR 检测海马组织中 BACE1,AMPK 等 mRNA 表达水平 14

2.2.4 Western blot 检测海马、皮层组织 AMPK,BACE1,p-Tau 等的蛋白表达水平. 19

2.3 统 计 学 处 理 23

3 结 果 24

3.1 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中自噬起始通路关键因子 AMPK、mTOR 及 mTORC2 复合物因子 Rictor、GβL 相对表达量的影响 24

3.2 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中自噬体形成相关自噬因子 Beclin-1, Atg12 蛋白及 mRNA 表达量的影响以及 Atg3, Atg7 蛋白表达量的影响

............................................................................................................................................. 34

3.3 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中对自噬体成熟标志物

LC3 及 自 噬 底 物 蛋 白 p62 相 对 表 达 量 的 调 节 作 用 45

3.4 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中学习记忆损伤关键因子 p-Tau, BACE1 的调节作用 53

 

4 讨 论 61

4.1 本 研 究 对 C57BL/6 小 鼠 各 生 命 节 点 的 分 组 依 据 61

4.2 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠脑组织自噬诱导因子 AMPK、mTOR 及

mTORC2 复 合 物 相 对 表 达 量 的 影 响 62

4.3 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠脑组织自噬体成熟相关因子 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 的调节作用 64

4.4 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中自噬体结合蛋白LC3 及选择性自噬底物 p62 的调节作用 67

4.5 生命早期铅暴露及白藜芦醇干预对小鼠海马及皮层组织中神经退行性病变特异性蛋白 BACE1, p-Tau 表达量改变 69

 

结 论 72

参 考 文 献 73

综 述 79

白 藜 芦 醇 对 神 经 退 行 性 疾 病 的 保 护 作 用 79

1 背 景 介 绍 79

2 白 藜 芦 醇 的 体 内 神 经 保 护 作 用 80

3 白 藜 芦 醇 的 体 外 神 经 保 护 作 用 84

4 白藜芦醇和其他衍生物的生物利用度和临床疗效 86

综 述 参 考 文 献 87

图表索引

表 1.1 实 验 动 物 分 组 13

表 1.2 白 藜 芦 醇 干 预 实 验 动 物 分 组 13

表 1.2 引 物 序 列 17

表 1.3 PCR 反 应 体 系 17

表 1.4 两 步 法 反 应 程 序 18

表 1.5 BSA 标 准 品 稀 释 表 20

表 1.6 SDS-PAGE 凝 胶 配 制 表 21

表 2.1 铅 暴 露 小 鼠 海 马 p-AMPK/AMPK 、 p-mTOR/mTOR 、 Rictor 、 GβL 蛋 白 相 对 表 达 量 24

表 2.2 白藜芦醇干预铅暴露小鼠海马组织 p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、Rictor、

GβL 蛋 白 表 达 量 的 影 响 26

表 2.3 铅 暴 露 小 鼠 皮 层 p-AMPK/AMPK 、 p-mTOR/mTOR 、 Rictor 、 GβL 蛋 白 相 对 表 达 量 27

表 2.4 白藜芦醇干预铅暴露小鼠皮层组织 p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、Rictor、

GβL 蛋 白 表 达 量 的 影 响 29

表 2.5 铅暴露小鼠海马组织 AMPK、mTOR mRNA 表达量(x ± SEM, n=9) 31

表 2.6 白藜芦醇对铅暴露小鼠海马 AMPK、mTOR mRNA 表达量的影响(x ± SEM, n=9)

..................................................................................................................................... 32

表 2.7 铅暴露小鼠皮层组织 AMPK、mTOR mRNA 表达量(x ± SEM, n=9) 33

表 2.8 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠皮层 AMPK、mTOR mRNA 表达量(x ± SEM, n=9)

..................................................................................................................................... 34

表 3.1 铅 暴 露 小 鼠 海 马 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋 白 表 达 量 的 变 化 趋 势 (x ± SEM, n=6) 34

表 3.2 白 藜 芦 醇 干 预 时 铅 暴 露 小 鼠 海 马 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋 白 表 达 量 (x ± SEM, n=6) 36

表 3.3 铅 暴 露 小 鼠 皮 层 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋 白 表 达 量 的 变 化 趋 势 (x ± SEM, n=6) 38

表 3.4 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠皮层 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋白表达量的影响

(x ± SEM, n=6) 39

表 3.5 铅暴露小鼠海马组织 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 表达的变化趋势 41

表 3.6 白藜芦醇干预时小鼠海马 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 表达量 42

表 3.7 铅 暴 露 小 鼠 皮 层 组 织 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 表 达 量 43

表 3.8 白藜芦醇干预对小鼠皮层组织 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 表达的影响 44

表 4.1 铅暴露小鼠海马组织 LC3II/LC3I 及p62 蛋白表达量的变化趋势 45

表 4.2 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠海马组织 LC3II/LC3I 及 p62 蛋白表达的影响 46

表 4.3 铅暴露小鼠皮层组织 LC3II/LC3I 及p62 蛋白表达的变化趋势 47

表 4.4 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠皮层组织 LC3II/LC3I 及 p62 蛋白表达量的影响 48

表 4.5 铅暴露小鼠海马组织 LC3a mRNA 表达量的变化趋势 49

表 4.6 白藜芦醇干预对小鼠海马组织 LC3a mRNA 表达量的影响 50

表 4.7 铅暴露小鼠皮层组织 LC3a mRNA 表达量的变化趋势 51

表 4.8 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠皮层组织 LC3a mRNA 表达的影响 52

表 5.1 铅暴露小鼠海马组织 BACE1、p-Tau 蛋白表达的变化趋势 53

表 5.2 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠海马组织 BACE1、p-Tau 蛋白表达的影响 54

表 5.3 铅暴露小鼠皮层组织 BACE1、p-Tau 蛋白表达的变化趋势 55

表 5.4 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠皮层组织 BACE1、p-Tau 蛋白表达的影响 57

表 5.5 铅暴露小鼠海马组织 BACE1 mRNA 表达的变化趋势 57

表 5.6 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠海马组织 BACE1 mRNA 表达的影响 58

表 5.7 铅暴露小鼠皮层组织 BACE1 mRNA 表达的变化趋势 59

表 5.8 白藜芦醇干预对铅暴露小鼠皮层组织 BACE1 mRNA 表达量的影响 60

图 1.1 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 海 马 组 织 AMPK 、 mTOR 、 Rictor 、 GβL 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 25

图 1.2 白 藜 芦 醇 干 预 时 铅 暴 露 小 鼠 中 海 马 组 织 AMPK 、 mTOR 、 Rictor 、 GβL 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 26

图 1.3 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 皮 层 组 织 AMPK 、 mTOR 、 Rictor 、 GβL 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 28

图 1.4 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠中皮层组织 AMPK、mTOR、Rictor、GβL 蛋白相对表达量的变化趋势 错误!未定义书签。

图 1.5 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 海 马 组 织 中 AMPK 和 mTOR mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 31

图 1.6 白 藜 芦 醇 干 预 时 小 鼠 海 马 组 织 中 AMPK 和 mTOR mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 32

图 1.7 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 皮 层 组 织 中 AMPK 和 mTOR mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 33

图 1.8 白 藜 芦 醇 干 预 时 小 鼠 皮 层 组 织 中 AMPK 和 mTOR mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 34

图 2.1 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 海 马 组 织 中 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 36

图 2.2 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠中海马组织Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋白相对表达量的变化趋势 错误!未定义书签。

图 2.3 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 皮 层 组 织 中 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 39

图 2.4 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠中皮层组织 Beclin-1, Atg12, Atg3, Atg7 蛋白相对表达 量 的 变 化 趋 势 40

图 2.5 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 海 马 组 织 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 41

图 2.6 白 藜 芦 醇 干 预 时 小 鼠 海 马 组 织 中 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 42

图 2.7 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 皮 层 组 织 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 43

图 2.8 白 藜 芦 醇 干 预 时 小 鼠 皮 层 组 织 中 Beclin-1 和 Atg12 mRNA 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 44

图 3.1 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 海 马 组 织 中 LC3II/LC3I 蛋 白 相 对 比 、 p62 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 46

图 3.2 白 藜 芦 醇 干 预 时 铅 暴 露 小 鼠 中 海 马 组 织 LC3II/LC3I 蛋 白 相 对 比 、 p62 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 47

图 3.3 小 鼠 铅 暴 露 时 间 序 列 中 皮 层 组 织 中 LC3II/LC3I 蛋 白 相 对 比 、 p62 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 48

图 3.4 白 藜 芦 醇 干 预 时 铅 暴 露 小 鼠 中 皮 层 组 织 LC3II/LC3I 蛋 白 相 对 比 、 p62 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 49

图 3.5 小鼠铅暴露时间序列中海马组织 LC3a mRNA 相对表达量的变化趋势 50

图 3.6 白藜芦醇干预时小鼠海马组织中 LC3a mRNA 相对表达量的变化趋势 51

图 3.7 小鼠铅暴露时间序列中皮层组织 LC3a mRNA 相对表达量的变化趋势 52

图 3.8 白藜芦醇干预时小鼠皮层组织中 LC3a mRNA 相对表达量的变化趋势 52

图 4.1 小鼠铅暴露时间序列中海马组织中 BACE1、p-Tau 蛋白相对表达量的变化趋势

......................................................................................................... 错误!未定义书签。

图 4.2 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠中海马组织 BACE1、p-Tau 蛋白相对表达量的变化趋势 错误!未定义书签。

图 4.3 小鼠铅暴露时间序列中皮层组织中 BACE1、p-Tau 蛋白相对表达量的变化趋势

..................................................................................................................................... 56

图 4.4 白 藜 芦 醇 干 预 时 铅 暴 露 小 鼠 中 海 马 组 织 BACE1 、 p-Tau 蛋 白 相 对 表 达 量 的 变 化 趋 势 57

图 4.5 小鼠铅暴露时间序列中海马组织 BACE1 mRNA 相对表达量的变化趋势 58

图 4.6 白藜芦醇干预时铅暴露小鼠中海马组织 BACE1 mRNA 相对表达量的变化趋势

..................................................................................................................................... 59

图 4.7 小鼠铅暴露时间序列中皮层组织 BACE1 mRNA 相对表达量的变化趋势 59

图 4.8 白藜芦醇干预时小鼠皮层组织中 BACE1 mRNA 相对表达量的变化趋势 60

缩略词表

 

英 文 缩 写 英 文 全 称 中 文 全 称

Aβ amyloidβprotein β 淀 粉 样 蛋 白

AD Alzheimer’s disease 阿 尔 茨 海 默 病

AMPK AMP-activated Protein Kinase 单磷酸腺苷活化蛋白激酶

APP amyloid precursor protein β 淀 粉 样 蛋 白 前 体 蛋 白

Atg Autophagy gene 自 噬 基 因

CTSB cathepsin B 组 织 蛋 白 酶 B

FeBAD fetal basis of adult disease 成 人 疾 病 的 胎 儿 基 础

LC3, MAP1LC3

microtube-associated protein 1 light chain 3

微管相关蛋白 1 轻链 3

LKB1 liver kinase B1 肝 脏 激 酶 B1

MAPK mitogen-activated protein kinase 丝裂原活化蛋白激酶

MAPs microtubule associated proteins 微 管 相 关 蛋 白

MCI mild cognitive impairment 慢 性 认 知 障 碍

mTOR Mammalian Target of Rapamycin 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

NFT neurofibrillary tangle 神 经 纤 维 缠 结

PE phosphatidyl ethanolamine 磷 脂 酰 乙 醇 胺

PI3K phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase

磷脂酰肌醇 3-激酶 1

Pb lead 铅

SP senile plaque 老 年 斑


1 引言

 

铅(lead, Pb)是一种环境中普遍存在并难降解的重金属污染毒物。从 18 世纪中叶的工业革命开始,全球范围内铅的制造和使用急剧增加以及电子产品在21 世纪里的井喷式发展,导致铅在大气、土壤、水中大量释放和积聚,近年来重金属铅的环境风险隐患仍然突出,慢性低浓度铅暴露在我国仍普遍存在,其引发的健康问题涉及神经、呼吸、血液、免疫、肾脏、肝脏和生殖系统等损害[1, 2]。铅暴露可诱导产生一系列中枢神经系统毒性效应,包括神经元凋亡、智商降低、认知障碍、注意力涣散以及攻击行为增加等大脑形态和功能损伤并与诸多神经退行性疾病和认知功能障碍的发生发展密切相关。

自噬是一种高度保守和保护性的细胞内过程[3, 4 ],负责溶酶体降解和连续去 除错误折叠的毒性蛋白质聚集体和损伤的细胞器以维持细胞稳态、功能完整性 和能量平衡[5]。据报道,一些重金属暴露可导致细胞自噬过程发生过度或者紊乱,使细胞开始程序性死亡,即分子生物学中的 II 型程序性细胞死亡[5]。铅暴露可以 促进体外培养的成骨细胞和心肌成纤维细胞中自噬发生[6, 7]。研究发现,铅暴露 可致大鼠睾丸上皮细胞中发生自噬反应并损害大鼠生殖能力[8]。另外,Likholat  等发现,使大鼠吸入醋酸铅气溶胶 1 周后,其肺部组织蛋白酶 B(cathepsin B, CTSB)表达量上调[9];而 CTSB 是溶酶体发挥降解细胞内沉积蛋白功能、实现 自噬、细胞内容物再利用的关键酶,间接说明了铅暴露对自噬过程的正向影响[10]。自噬在介导神经元损伤中扮演了重要作用,在行为学层面与学习记忆及认知障 碍密切相关。研究显示,空气中富含铝、锌、铬、镉、锰、铅、铜和镍等金属元 素的超微颗粒使 SH-SY5Y 神经细胞中自噬体标记物 LC3-II、Atg3 和 Atg7 表达 上调,同时细胞内 II 型程序性细胞死亡发生率增加[11, 12]。有研究发现,锰通过触发自噬-溶酶体功能障碍激活了在小鼠海马中和 BV2 细胞的 NLRP3-CASP1 炎症小体通路,促进神经元发生炎症反应,损害海马神经元细胞,进而降低小鼠海马依赖的学习和记忆功能[10]。哺乳动物不同脑区行使的功能有所差异,其中内侧颞叶系统即海马及其相邻皮层区是公认的学习记忆密切相关结构[13]。对人和动物的短期记忆研究发现,海马区是短期记忆功能最重要的结构基础。据报道,短期记忆是长期记忆的基础,而且长期记忆的保存需要海马神经元内多种学习记忆相关信号因子参与[13, 14, 15]。前额叶皮层也是参与学习记忆的关键功能脑区,其对于长期记忆功能更具有影响力[16]。海马区与皮层区在参与小鼠进行 Morris 水迷宫测试时,海马区发挥了主要作用。本研究中更加关注海马区在短期记忆中的主要作用,而皮层区也是参与记忆调节的的重要脑区,因此海马及皮层区均是本次研究中主要观察的脑组织区域。

研究发现,激活自噬可以增强焦虑诱导的记忆功能障碍[17]。此外,在 AD 患者脑中营养障碍性轴突中、动物神经退行性病变模型脑组织中以及 AD 样变细胞模型中可出现明显的自噬体堆积、晚期自噬空泡滞留现象,提示自噬在神经退行性病变尤其是 AD  样变中可能存在溶酶体与自噬泡融合及自噬体降解功能障碍现象[18, 19, 20]。在调控学习记忆能力中作用的相关研究中,BACE1、APP、Aβ是主要的分子标志物。有研究证实自噬在 Aβ 的产生或沉积、APP 的代谢和神经元死亡中发挥关键作用[21, 22, 23]。

值得注意的是,以上自噬与学习记忆相关的研究中有很多关于 AD 样变的研究报道,而当 AD 样变作为一种主要观察对象时,年龄因素也必须被作为一个重要研究因素。研究发现自噬与衰老存在关联;在正常衰老的人类大脑中自噬因子的 mRNA 水平下调,而在 AD 患者大脑中其转录表达却上调[24]。另一方面,基于成人疾病的胎儿基础(fetal basis of adult disease, FeBAD)假说,Zawia 博士和他的研究团队首次报道了生命早期铅暴露可以上调老龄大鼠 APP 的表达,并促进 Aβ 的生成[25]。本课题组前期研究发现,对铅暴露以及白藜芦醇干预后小鼠采用 Morris  水迷宫进行测试后发现,铅暴露使小鼠学习记忆损伤。铅暴露可促进小鼠海马组织中活性氧(ROS)产生,抑制超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等能清除 ROS 的酶活性,使小鼠海马组织中的 DNA 发生氧化损伤。此外,铅暴露使皮层中 Aβ1-40  产生增加,而白藜芦醇可以抑制其含量上调,减少 APP mRNA 表达[26, 27]。 最为重要的是,近期研究显示生命早期铅暴露下调学习记忆信号通路中关键蛋白 BDNF  和 p-TrkB  表达的同时,老年小鼠海马

SIRT1 的磷酸化表达受到抑制。SIRT1 的激活导致 LKB1 的脱乙酰化和活化,同 时可以增加 AMPK 磷酸化和活性。长寿蛋白 1(SIRT1,sirtuin1)是一种常见的 组蛋白乙酰酶,在细胞代谢、氧化应激及遗传稳定的调节过程中发挥重要作用[28]。研究发现,能量限制时,SIRT1 激活了其下游作为能量传感器的 AMPK 信号因 子,借助 GAPDH 将细胞质 AMPK 转移至核中与 SIRT1 相互作用,从而激活SIRT1 这种关键脱乙酰酶用于启动自噬[29]。据报道,在哺乳动物中 AMPK 或ULK1 的缺失导致自噬底物 p62 的异常积累和缺陷性线粒体自噬[30]。以上研究结果均提示铅暴露致学习记忆损伤及衰老与自噬存在分子水平上的内在关联。据此,在探讨铅暴露及增龄与神经功能关联的基础上,分析自噬对学习记忆损伤的调控作用具有可行性。

根据细胞内成分供给溶酶体进行降解的机制,自噬被分为三类:微自噬,分 子伴侣介导的自噬和巨自噬。自噬通路集合了多种信号传导途径来调节细胞生 长,细胞增殖,细胞活性和细胞存活。巨自噬是最主要的自噬形式,并将在此研 究中进行深入探讨。自噬相关因子在调控巨自噬阶段时可以被划分为三个阶段:自噬诱导阶段、自噬体成熟阶段及自噬降解阶段。自噬的调节涉及许多信号传导 途径,如磷脂酰肌醇 3-激酶 1(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, PI3K)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)途径和丝裂

原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径[31, 32]。mTOR 是

AMPK 下游的一个靶点蛋白、哺乳动物自噬的主要调节者,也是多种自噬诱导阶段的主要参与者[33]。它通过调节蛋白翻译参与一些重要细胞活动,如代谢应激、细胞存活、细胞增殖和细胞生长以及维持在细胞内环境稳定和代谢需求中发挥重要作用[34]。在 AMPK/ mTOR 通路中,下调的 mTOR 会促进自噬,这是一种经典的自噬诱导途径[35]。当 mTOR 下调时,可以促使其下游的 ULK 激酶与 Atg13以及骨架蛋白 FIP200 形成一个复合物并激活 III 级 PI3K 复合体。III 级 PI3K 复合体包含 hVps34、Beclin-1、p150 和 Atg14 样蛋白,是自噬过程必须的调控因子 [36, 37]。而自噬体的形成需要 Atg12-Atg5 结合 LC3II 后共同促进自噬体成熟,以完成自噬体成熟[38]。LC3,即微管相关蛋白 1 轻链 3((microtube-associated protein 1 light chain 3, MAP1LC3)是酵母 Atg8 的哺乳动物直系同源基因,它是促成自噬的主要步骤的关键蛋白[5, 39]。Atg7 是一种泛素激活 E1 酶的同源物,在一个依赖 ATP 催化过程中它可以同时激活 LC3 和 Atg12。p62 蛋白,在人体中又称 sequetosome 1(SQSTM 1)蛋白,它可以选择性运载自噬底物、参与自噬降解过程,在整个自噬过程中发挥重要作用。研究发现,p62 水平的上升是自噬受抑制的一种标志[40, 41]。

白藜芦醇(Resveratrol, Res)是一种纯天然多酚类物质(3,4’,5-三羟基二苯乙烯),近年来其反式结构因活性较高且较稳定在学界中大受欢迎[42]。白藜芦醇预防多种神经退行性疾病及代谢性疾病方面、延长寿命方面的研究较多,尤其是白藜芦醇与神经功能障碍的关系越来越受到关注[43]。白藜芦醇与神经元自噬交互作用研究已有很多报道。白藜芦醇作为 AMPK 激活剂可在自噬诱导阶段促进自噬发生。有研究还显示,白藜芦醇可下调神经元内 Beclin-1、Atg12 及 Atg5 因子的表达[44]。白藜芦醇与自噬的关系在不同组织和不同染毒方式中表现各异。

基于以上分析,探讨生命早期铅暴露致小鼠学习记忆损伤的长期效应研究的基础上,本课题以 AMPK/mTOR 为切入点进行自噬调控相关通路研究,同时观察 BACE1, p-Tau 等神经退行性病变相关分子的表达趋势。此外,使用白藜芦醇进行干预研究,探讨其对小鼠铅暴露后脑组织自噬通路关键因子的影响及其机制。上述相关研究可为在分子水平探索铅的神经毒性损伤机制提供新的线索。


2 材料与方法

 

2.1 实验材料

 

2.1.1 实验动物

本实验所采用实验动物为 SPF 级 C57B/L 小鼠雌性 23 只和雄性 8 只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCX(京)2006-2009)。

2.1.2 主要试剂与耗材

 

试剂名称


生产厂家

醋酸铅


阿拉丁生物公司

盐酸


洛阳市化学试剂厂

三羟甲基氨基甲烷(Tris)


美国 Genview 公司

乙醇


国药集团化学试剂有限公司

羧甲基纤维素钠


南京景竹生物科技有限公司

EDTA 粉剂


BOISAIL 生物公司

 

 

PVDF 膜


北京鼎国昌盛生物技术有限公司

 

 

Tween-20

甘氨酸


北京康为世纪生物技术有限公司

美国 Genview 公司

蛋白酶抑制剂混合物


北京鼎国昌盛生物技术有限公司

牛血清白蛋白(BSA)

eECL 化学发光试剂盒


美国 Genview 公司

美国 Genview 公司

铅标准物质


瑞士万通生物公司

丽春红染液


美国 Genview 公司


 

6



 

试 剂 名 称 ( 续 表 ) 生 产 厂 家

预 染 Marker 美 国 Genview 公 司

浓 硝 酸 洛 阳 市 化 学 试 剂 厂

BCA 蛋白浓度测定试剂盒               北京鼎国昌盛生物技术有限公司辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠 IgG    碧云天生物科技公司

RIPA 裂解液(强) 北京康为世纪生物技术有限公司

SDS-聚丙烯酰胺凝胶试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限公司

白 藜 芦 醇 南 京 景 竹 生 物 科 技 有 限 公 司

水 合 氯 醛 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司

蛋白磷酸酶抑制剂混合物 北京鼎国昌盛生物技术有限公司

高 氯 酸 洛 阳 市 化 学 试 剂 厂

辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔 IgG    Millipore 公司

Antiβ-actin antibody 北京博奥森生物技术有限公司 Anti AMPK antibody(D5A2) Cell Signaling Technology 公司 Anti pAMPK antibody(Thr172) Cell Signaling Technology 公司 Anti mTOR antibody(7C10) Cell Signaling Technology 公司 Phospho-mTOR(Ser2448)(D9C2) antibody Cell Signaling Technology 公司 Anti Atg12 antibody Cell Signaling Technology 公司

Anti Beclin-1 antibody Cell Signaling Technology 公 司

Anti Atg3 antibody #3415 Cell Signaling Technology 公 司

Anti Atg7 (D12B11) antibody Phospho-Tau (Ser416) antibody

Anti BACE1 antibody (ab108394)

Cell Signaling Technology 公司

Cell Signaling Technology 公司

Abcam 公司

MAP LC3α/β 抗 体 (H-47): sc-398822 Santa cruz 公 司

SQSTM1/p62 antibody Cell Signaling Technology 公 司


试 剂 名 称 ( 续 表 ) 生 产 厂 家

TRIzol 总 RNA 提 取 试 剂 Thermo Fisher 公 司

DNA marker DSTM2000 广 州 东 盛 生 物 科 技 有 限 公 司

cDNA 第一链合成试剂盒 南京诺唯赞生物科技有限公司

AMPK 上下游引物 生工生物工程(上海)股份有限公司

mTOR 上下游引物 生工生物工程(上海)股份有限公司

Atg12 上下游引物 生工生物工程(上海)股份有限公司

Beclin-1 上下游引物

LC3α/β上下游引物

生工生物工程(上海)股份有限公司生工生物工程(上海)股份有限公司

2x 普通 Taq 酶 PCR Master Mix 北京百泰克生物技术有限公司 SYBR ?Green 染料法荧光定量 PCR 南京诺唯赞生物科技有限公司 核糖核酸酶抑制剂 DEPC 江苏凯基生物技术股份有限公司

 

2.1.3 主要试剂及其配制

(1)0.2%醋酸铅溶液:于室温 20-25℃、干燥、避光处称量醋酸铅粉剂 2g,将其溶解于无菌去离子水中并定容至 1000mL,室温避光处存放,使用前为避免有沉淀需摇匀,尽量现用现配。

(2)1.0 mol/L Tris- HCl (pH=7.5):于室温 20-25℃、干燥处称量三羟甲基氨基甲烷 30.29 g,将其溶解于无菌去离子水中并定容至 200mL,用浓盐酸将其进行 pH 值标定于 7.5,标定 pH 后加入去离子水并定容至 250mL,再次高温高压灭菌后冷却至室温待用。

(3)10×TBS 缓冲液:于室温 20-25℃、平稳处,称量 1.0 mol/L Tris- HCl (pH=7.5) 200mL 置入大烧杯中,并称量 88g NaCl 加入所称取溶液内,加入少量去离子水搅拌均匀后转移至 1L 容量瓶内继续用去离子水进行定容,定容后室温保存。

(4)1×TBST 缓冲液:于室温 20-25℃、平稳处,量取 10×TBS 100mL,并加入 Tween20 500μL 后反复震荡混匀后加入去离子水定容至 1000mL,置于 4℃环境保存,使用前需注意混匀。

(5)10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(PH=8.3):于室温 20-25℃、干燥处称量 SDS 12.5g,甘氨酸 180g,三羟甲基氨基甲烷(Tris)37.5 g 后置于清洁大烧杯中,加入大约 900mL 去离子水充分搅拌,并待新溶液温度降至室温后转移到容量瓶并定容至 1000mL  ,常温存放、现用现配,每次使用前需用去离子水稀释至 1×后方可使用。

(6)10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液:于室温20-25℃、干燥处称量三羟甲基氨基甲烷 30.3 g,甘氨酸 151.1 g后置于清洁大烧杯中,加入大约900mL去离子水充分搅拌,并待新溶液温度降至室温后转移到容量瓶并定容至1000mL,常温存放、现用现配,每次使用前需用去离子水稀释至1×后并根据待转膜目的蛋白分子量大小加入甲醇溶液至1×,置于4℃环境保存,使用前需注意混匀。甲醇加入量:mTOR, p-mTOR, Raptor, Rictor分子(分子量200~400kDa)需在甲醇浓度为5%的转模缓冲液中进行转膜,AMPK, Atg12, Beclin-1, LC3-I/II蛋白分子(分子量10~80 kDa)需在甲醇浓度为20%的转模缓冲液中进行转膜,浓度为5%时缓冲液需现用现配,浓度为20%时缓冲液最多可重复利用三次。

(7)(脱脂奶粉或BSA)5%封闭液:于室温20-25℃、干燥处称量BSA或脱脂奶粉 0.3g置于干燥有盖的试管中,加入TBST 6mL,充分震荡使其均匀溶解后即可使用,使用后回收至洁净试管内,存放于4℃冰箱中,并且可以反复利用2~3次。根据待检测目的蛋白的抗体说明书决定使用何种封闭液,多数时候磷酸化蛋白需避免使用脱脂奶粉封闭液,因其可能含有磷酸酶将磷酸化蛋白酶解。

(8) 考马斯亮蓝染色液:于室温20-25℃、干燥、避光处称量考马斯亮蓝0.625g,将其溶解于125mL乙醇中充分搅拌均匀后,再于通风处加入冰醋酸40mL,待其温度降至室温后转移至容量瓶中了,加入去离子水定容至500mL,避光存放于室温内。

(9) 考马斯亮蓝脱色液:于室温20-25℃、干燥、通风处称取甲醇150mL,冰醋酸50mL置于大烧杯中搅拌均匀并待其缓慢降温至室温后,转移至容量瓶内,加入去离子水定容到500mL,室温保存。

(10)0.2%醋酸铅水溶液:于室温20-25℃、干燥处称取醋酸铅2g,将其溶解于去离子水中,适当加入少量冰醋酸助溶,充分搅拌直至溶液中无粉末,待醋酸铅完全溶解后,将溶液移至1000mL的容量瓶中,并定容到1000mL。

(11) 水合氯醛溶液:于室温20-25℃、干燥、避光处称取10g水合氯醛,现配现用,将其溶于去离子水中,充分搅拌后转移至容量瓶内,定容到 100mL,注意避光操作。

(12) 乙二胺四乙酸盐EDTA溶液(血液抗凝剂):于室温20-25℃、干燥处称取EDTA 0.15g,溶解于灭菌超纯水中,并将其定容至100mL,现配现用。

(13) 灌胃溶液配制(羟甲基纤维素钠及白藜芦醇灌胃液):于室温20- 25℃、干燥处称取羟甲基纤维素钠 0.5g溶于去离子水100mL中(磁力搅拌2个小时),至溶液澄清粘稠无颗粒状物质存在,此时即已配制成为羟甲基纤维素钠水溶液(粘稠状)。再称取白藜芦醇 0.5g,加入配制好的羟甲基纤维素钠水溶液中;充分搅匀,4℃保存,使用期限不可超过1周。

(14) 焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液(0.1%)配制:DEPC呈现油状,难溶于水,而且毒性极强,配制时需在室温20-25℃、避光、通风橱内进行。称取高压灭菌后的超纯水1000mL于容量瓶内,加入1mLDEPC溶液后密封并反复震荡

10分钟后置于阴凉干燥处隔夜存放后方可使用。每次使用前需震荡摇匀,减少溶液暴露与空气的时间。


2.1.4 主要仪器与设备

 

仪 器 名 称 生 产 厂 家

实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 Thermo Fisher 公 司

搪 瓷 方 盘 南 昌 仪 科 实 验 仪 器 设 备 有 限 公 司

1mL 注 射 器 新 乡 市 康 林 医 疗 器 械 有 限 公 司

分 析 天 平 岛 津 公 司

离 心 管 北 京 康 为 世 纪 生 物 技 术 有 限 公 司

组织匀浆器 1mL 北京康为世纪生物技术有限公司

96 孔 微 孔 板 NEST 公 司

移 液 枪 (10/200/1000μL) 德 国 eppendorf

研究型精密电子天平 双杰测试仪器厂

HH-42 型快速恒温数显水箱 国华电器有限公司

普 通 冰 箱 中 国 海 尔 公 司

HVE-50 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 日 本 Hirayama

高 速 低 温 离 心 机 美 国 sigma

SUNRISE 酶 标 仪 美 国 Tecan

漩 涡 振 荡 器 金 达 生 化 仪 器 厂

LDZ4-0.8 离 心 机 北 京 医 用 离 心 机 厂

-80℃ 冰 箱 日 本 SANYO 公 司

DHG-9145 型电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 Amersham Imager 600 凝胶成像系统 美国 GE Healthcare 公司 DYY-6C 电泳仪 北京市六一仪器厂

荧 光 定 量 PCR 八 连 排 Thermo Fisher 公 司

Milli-Q synthesis 超 纯 水 仪 美 国 Millipore 公 司

荧 光 定 量 PCR96 孔 板 Thermo Fisher 公 司


仪 器 名 称 ( 续 表 ) 生 产 厂 家

无 酶 离 心 管 美 国 Axygen 公 司

797 伏 安 极 谱 仪 瑞 士 万 通

 

2.2 实验方法

 

2.2.1 动物饲养及分组

实验动物自北京维通利华实验动物技术有限公司购回后,在符合规定的饲养环境中进行饲养。动物实验室环境要求:环境温度 20-25 摄氏度,相对湿度 40%-

60%,照明与黑暗各 12 小时,清洁要求:SPF 级,控制铅污染(防尘、减少各类金属器具出入实验室机会、经常清洁笼具、清洗饮水器)。购买 8 周龄健康

C57BL/6 小鼠进行培育,将其按照雌雄比为 3 比 1 进行繁殖配对,选择其中健康小鼠作为研究对象,进行繁殖。每日早晚各一次观测雌鼠体重及其是否出现阴道栓,若发现雌鼠受孕则将其单独饲养,并在平时标准化饲料喂养的基础上添加熟鸡蛋、花生等食物以增加雌鼠营养。雌鼠分娩出幼鼠后,控制室内音量防止雌鼠受到惊吓发生啃食幼鼠和断乳情况。继续正常喂养雌鼠和幼鼠直至 4 周后分辨幼鼠性别,并选择雄性幼鼠进行后续研究。

对于使用白藜芦醇及羟甲基纤维素钠灌胃小鼠需轻柔操作,灌胃针使用前高压灭菌,并注意同组灌胃小鼠使用相同用具。本课题组前期经查阅文献、预实验等过程,确定小鼠铅暴露或称染铅方式为自由饮用含 0.2%醋酸铅的去离子水。白藜芦醇干预方式为将白藜芦醇(Res)溶解于羟甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液中隔天灌胃,每日灌胃剂量为 50mg/kgBw·d,灌胃量 0.1ml/10g。

购买实验动物至雄性幼鼠产出及培养过程约需 6 个月,获得 4 周龄雄性幼鼠 后根据外观(毛发光泽、四肢健全)、行为(活跃、灵敏)特征筛选雄性幼鼠进 入实验。需对实验观察所用雄性幼鼠进行随机配对分组,分组依据为体重和窝别,应用此法将幼鼠分为 5 组,每一组幼鼠再随机平均分成两组,总共 10 组幼鼠,每组 15 只,依照表 1.1 及表 1.2 进行染毒或干预。本课题研究时程跨度较长,在实验过程中出现了动物伤亡等使其不能继续作为观察对象的情况,据此相应调整各组幼鼠数量,最终得到每组 7-12 只共 10 组幼鼠标本。

表 1.1  实验动物分组

 

组别及分组代号

n

染毒或干预

4月龄对照组,4C

10

自由饮用去离子水3个月

4月龄染铅组,4Pb

10

自由饮用含0.2%醋酸铅的去离子水3个月

13月龄对照组,13C

8

自由饮用去离子水13个月

13月龄染铅组,13Pb

8

自由饮用含0.2%醋酸铅的去离子水3个月后再自



由饮用去离子水9个月

16月龄对照组,16C

7

自由饮用去离子水16个月

16月龄染铅组,16Pb

7

自由饮用含0.2%醋酸铅的去离子水3个月后再自



由饮用去离子水12个月

 

表 1.2 白藜芦醇干预实验动物分组

组别及分组代号

n

染毒或干预

灌胃对照组,

12

自由饮用去离子水3个月后开始隔天CMC-Na灌

C


胃12个月

白藜芦醇对照组,

12

自由饮用去离子水3个月后开始隔天白藜芦醇

CR


(Res)灌胃12个月

铅暴露灌胃对照组,

12

自由饮用含0.2%醋酸铅的去离子水3个月后再开

Pb


始隔天CMC-Na灌胃12个月

白藜芦醇干预组,

12

自由饮用含0.2%醋酸铅的去离子水3个月后再开

PbR


始隔天白藜芦醇(Res)灌胃12个月

 


2.2.2 小鼠脑组织采集

待小鼠完成染毒及干预处理并进行完其他相关实验(如行为学实验等)后,准备小鼠脑组织标本采集所需冻存管(数量应是所需数量的至少1.5倍,以备多余组织待用)。将冻存管提前三天浸泡于DEPC溶液中以抑制RNA酶活性,经过浸泡后的冻存管需高压灭菌并烘干后可以使用,使用前需提前根据动物分组名称和序号对冻存管进行编号标注。小鼠处死前夜需禁食、配制浓度为10%的水合氯醛麻醉剂。

处死小鼠前将小鼠至于电子天平上进行称重,记录体重,根据体重吸取麻醉剂(0.8mL/100g)。小鼠麻醉后肢体活动消失、呼吸均匀时迅速摘出小鼠眼球取血,所收集血液的离心管在灭菌处理后需加入0.15%EDTA 80μL,待眼球部血液流出缓慢(少于2秒钟一滴)时停止取血,并将新收集过血液的离心管反复上下颠倒震荡,避免震荡过于剧烈使血细胞破碎,立即放入-20℃冷冻室进行冷冻保存。

完成留取血液后,小鼠已无生命体征,迅速用手术剪将小鼠断头、组织剪去除头皮、硬质钝性镊子将脑组织周围头骨夹碎使其完全暴露于视野中,钝性分离皮层和海马部分,用预冷后的生理盐水缓慢冲洗后称重、记录,置于DEPC浸泡过的冻存管,立即放入-80℃冷冻室进行冷冻保存。

2.2.3 Real-time PCR 检测海马组织中 AMPK 等 mRNA 表达水平

 

2.2.3.1 海马中总 RNA 的提取

准备工作:在 0.1%DEPC 溶液中过夜浸泡匀浆器、离心管,浸泡过的匀浆器等进行高压蒸汽灭菌、烘干、编号待用。匀浆器、离心管冰上预冷。试剂准备:异丙醇,75℅乙醇,氯仿,无 RNase 水或 0.5℅SDS(溶液均需用 DEPC 处理过的水配制)。

(1) 称取已冻存的小鼠脑部海马组织100~150 mg,置于在冰上预冷的匀浆器内低温环境中磨碎,加入1~1.5mL TRIzol试剂后进行匀浆,研磨至无固体物质而且均匀透明状后即可停止匀浆。将匀浆迅速转移至预冷后的离心管中,冰上静置5min,使TRIzol与组织有充分的反应时间。这一步可使核酸蛋白完全分离。 

(2) 将静置后的含组织匀浆液离心管放入低温离心机(4℃)、尽量配平后开始以12000g,10min进行离心,离心完成后取上清液置入新的离心管。向转移出来的上清液中加入预冷氯仿200μL并充分高速震荡20s,加速辅助溶液乳化。乳化后的溶液呈现橘红色浑浊状态而且无分层现象,室温静置3min。

(3) 静置后的溶液再次放入低温离心机(4℃)、尽量配平后开始以12000g,15min进行离心,此时可见离心管中溶液分为三层:上层黄色为清水相、中层白色、下层粉红色为有机相,小心吸取清水相(其容积约为所加入TRIzol的60%)转移至另一新离心管中。

(4) 向分离出清水相的新离心管中加入等体积的异丙醇,震荡均匀后,室温静置10min。

(5) 静置后的溶液放入低温离心机(4℃)、尽量配平后开始以12000g,10min进行离心,小心取出后去除上清液,沿着离心管管壁缓慢加入1mL75%的乙醇(用DEPC处理过的水配制),轻轻混匀。每使用1mL凯基TRIzol试剂至少加1mL75%的乙醇。 

(6) 混匀后的溶液放入低温离心机(4℃)、尽量配平后开始以12000g,10min进行离心,小心取出后吸取所有上清液,敞开离心管口2~5min使其中的沉淀物干燥(经常观察离心管,沉淀物干燥过程中防止液体完全挥发,以防RNA难以溶解),干燥后立即加入50μL无酶水完全溶解RNA。尽快将完全溶解后的RNA溶液低温保存(-70℃)。

(7) 将所提取出的RNA样品用测定其浓度、纯度和完整性,测定后根据使用量分装至两到三个离心管。


2.2.3.2 海马 RNA 的浓度、纯度和完整性测定

使用ND5000超微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度和纯度。在已连接ND5000超微量紫外可见分光光度计的电脑中启动测量软件,进入待用状态。使用时需准备去RNA酶水、去除RNA移液器枪头、喷洒过DEPC水并高压灭菌烘干后的擦镜纸若干。每次测量前后需滴加2μL去RNA酶水于测量表面进行清洗和调零,测量待测样品前需用擦镜纸轻柔擦拭测量表面。测量样品时每次上样2μL,观察OD260/280 值在1.8~2.1之间说明纯度良好。测量期间注意记录样品编号、OD260/280值以及测量结果。

 

2.2.3.3 逆转录

此实验步骤所使用试剂来自诺唯赞公司。 

遵从说明书,准备好相关用品和试剂,按照反应体系要求进行配制,全程需低温操作。具体步骤如下:

(1) 向准备好的小离心管内加入2μL 4×gDNA wiper Mix,顾名思义,这一步可以去除基因组内残余DNA,再加入质量符合试剂盒要求量(1pg~500ng)的

RNA,最后需到达8μL方能符合此步骤反应要求,不足的体积用去RNA酶水补齐。将小离心管置于42℃恒温水浴箱内水浴2min。

(2) 向第(1)步的离心管中加入2μL 5×SuperMix Ⅱ并吹打混匀,这一步会实现RNA的逆转录。将待逆转录小离心管分别置入不同温度水浴锅进行逆转录,水温及温度要求:25℃ 10min;50℃30min;85℃ 5min。

(3) 水浴结束即是逆转录完成时,每管cDNA中加入去RNA酶水40~50μL,反复吹打混匀后将所得cDNA储存于-20℃冷冻备用。


热门搜索问题:


代写硕士论文价格


代写硕士论文成功案列


代写硕士论文流程

天天论文网
专注硕士论文服务

24小时免费热线

SERVICE ONLINE

13503820014

手机扫描二维码

收缩
  • 电话咨询

  • 13838208225