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7C%基因的互补验证及功能分析

作者:admin1 日期:2022-04-07 10:56:30 点击:368

第4章7C%基因的互补验证及功能分析

为了验证图位克隆的正确性,确定tcd6的突变表型就是由编码PPR蛋白的 TCD6基因突变引起的,我们设计了 TCD6基因的互补实验并对该基因的功能进行 了验证分析。

4.1   实验材料

以突变体tcd6亲本作为TCD6基因的互补材料;亚细胞定位的材料用的是本 氏烟草;互补实验中所用到的质粒载体是由中国科学院上海生命科学研究院提供 的具有卡那霉素抗性的PCAMBIA1301质粒;亚细胞定位所用到的质粒载体是上海 师范大学杨仲南教授实验室提供的具有庆大霉素和壮观霉素抗性的pMO530-G/P 载体;载体构建以及互补侵染所用到的菌株分别是:大肠杆菌DH5a、大肠杆菌 DH10B以及农杆菌EHA105; TCD6基因功能验证时所用到的材料是生长在32°C人 工气候培养箱中的“嘉花1号”和tcd6突变体亲本的叶片;菌株培养所用的培 养基为LB和YEB;所用到的抗生素为:氨苄霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大 霉素、利发霉素,浓度均为 0.1g/ml。

LB培养基所含有的有效成分如下:胰蛋白胨10g;酵母提取物5g; NaCl固体10g; 琼脂15g;用容量瓶定容至1L,然后调pH=7. 6,分装, 121C、1.05 个大气压灭菌 20min 备用。

YEB培养基所含有的有效成分为:胰蛋白胨10g;酵母提取物5g; MgS04*7H20 0. 5g; 蔗糖5g;琼脂15g;用容量瓶定容至1L,然后调pH=7. 0, 分装,121C、1.05个大气压灭菌20min备用。

4.2   试验方法

2.  2. 1总RNA的提取及反转录

本实验RNA提取用的是南京诺唯赞公司的R701RNA提取试剂盒,cDNA的反 转录用的是南京诺唯赞公司提供的Vazyme HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒,具体过程如下:

RNA 的提取:

(1)  称取0.05g水稻叶片新鲜组织,将叶片放入预先经液氮冷冻的研钵中,并 迅速倒入液氮进行研磨,研磨期间不断加入液氮,防止RNA被降解;

(2)     将研磨后的水稻叶片粉末迅速转移到1.5ml的无RNA酶的空的离心管中, 然后加入600吐的RNA-easy,上下颠倒,涡旋机涡旋1min;

(3)   向涡旋后的离心管中加入240吐的不含RNA酶的ddH2O,上下颠倒混匀, 涡旋机涡旋15sec,涡旋后在室温下放5min;

(4)   将静置后的离心管放入离心机中,12000g转速,室温离心15min;

(5)   取出离心管,用移液枪小心地将上清液转移到另一个空的1. 5ml的没有RNA 酶的离心管中,然后加入等体积的异丙醇溶液,上下颠倒混匀,放在室温下等待 10min;

(6)   静置过后离心机12000g室温离心10min;

(7)   倒掉上清液,加入500吐的75%酒精溶液,轻弹管底使沉淀悬浮;

(8)   8000g转速室温离心3min,弃上清;

(9)   重复步骤 7 和 8 一次,充分弃上清,室温下晾干 2min;

(10)   晾干后往离心管中加入50吐的无RNA酶污染的ddH2O,室温涡旋3min。 RNA反转录为cDNA的步骤:

(1) 基因组DNA去除(在RNase-free离心管中配置)

RNase-free ddH2O                        2吐

4X gDNA wiper Mix                       4yL

Oligo (dT) 23VN (50yM)                 1 吐

Random hexamers (50ng/yL)               1yL

Total RNA                               8yL

将以上体系混匀,42°C,2min;

(2) 配制第一链cDNA合成反应液:

上一步的混合液                        16yL

10X RT Mix                             2yL

HiScript II Enzyme Mix 2yL 反应条件:55C, 15min; 85C, 2min;

(3) 将反应后的20吐溶液加150yL也0稀释。

4.2.2   载体构建

I、互补载体的构建:

用野生型“嘉花1号”基因组DNA作为PCR扩增模板,扩增得到TCC6基因 组全长2753bp以及其前后1. 5kb和0. 4kb的序列,PCR反应体系及程序参照第3 章,测序正确后连接到pCAMBIA1301质粒载体上;其中引入的双酶切位点为SacI 和Sall,连接用的是Treliej™ SoSoo Cloning Kit同源重组克隆试剂盒,具体过程 如下:

1、 根据NCBI网站上公布的TCD6基因组序列用CE Design软件设计同源重组的 特异性引物,引物序列为:

F: 5' -catgattacgaattcgagctcAAATTTAGTCAATTTAAAGATGTTTGACTAGA- 3'(其中 单划线的部分为pCAMBIA1301质粒载体的同源部分,双划线部分为引入的SacI 酶切位点);

R: 5' -cttgcatgcctgcaggtcgacAGATAGATTTATATAATTAACAGAACATATACTAATTTC-3'

(其中单划线的部分为PCAMBIA1301质粒载体的同源部分,双划线部分为引入的 SalI 酶切位点);

2、 PCR扩增后,产物用康为世纪的胶回纯化试剂盒胶回纯化,步骤参照操作说 明书。

3、 同源重组连接:

(1)制备线性化克隆载体:用 SacI 和 SalI 两种限制性核酸内切酶酶切消化 pCAMIA 1301质粒载体,使载体线性化,酶切结束后,电泳胶回。

(2)连接体系(10yL):

线性化载体

1. 5yL

目的片段

3yL

2X SoSoo Mix

5yL

ddH20

0. 5吐

(3)重组反应条件:50C,20min。


II、TCD6基因亚细胞定位载体的构建:

为了确定TCD6基因所编码的蛋白定位于植物细胞的哪个位置,我们通过构 建pMN530-TCD6GFP亚细胞定位载体,通过对烟草原生质体的转化,研究TCD6 蛋白的亚细胞定位情况。具体过程如下:

1、 以野生型“嘉花1号”的cDNA为模板,扩增出包含TCD6基因信号肽及起始 密码子在内的cDNA片段,全长为453bp。扩增所用到的上下游引物序列为:

F:5' -GAAGATCTATGGTGTGCTCCGTGGCTGCC-3'(其中下划线部分为引入的 Bgl II 酶 切位点);R: 5' -GGGGTACCCATCCTGACGACCATCTCCAT-3'(其中下划线部分为引入 的Kpn I酶切位点);

2、 扩增后的 DNA 片段切胶回收(步骤参见康为世纪的胶回纯化试剂盒),将胶 回后的产物进行加“A”(腺嘌吟脫氧核糖核甘酸)处理,反应体系及条件如下: 胶回产物 35yL 加入 1 吐Tag 酶、6. 2吐Mg2+、1. 3yLdNTP、6. 5^LddH2O 构成 50yL 反应体系,72C反应30min;

3、 力““A”后的反应产物连接pMD18-T载体,产物5吐加入0. 5yL18T载体、4. 5吐 连接液solution I构成10yL反应体系,然后16C过夜连接; 

4、 将连接产物转入到大肠杆菌DH5 a感受态中,划线培养,挑取单克隆,测序 验证并酶切,具体步骤如下:

(1)  从-80C的超低温冰箱中取出用于转化的大肠杆菌DH5a感受态细胞,然后 将其放到冰盒上融化;

(2)   取100吐的感受态细胞到1. 5ml的EP管内,EP管需预先放在冰上预冷;

(3)   加入15吐用于转化的质粒溶液轻轻吹打混匀;

(4)   冰浴30min,接着42C水浴90s,接着冰浴3min,水浴锅要提前开启预热;

(5)   然后往离心管中加入900yL的LB液体培养基,该培养基在加入前经37C 预热过并且不含有抗性;将离心管放入37C的恒温摇床中,200rpm摇1个小时;

(6)   取出摇床中的离心管放入离心机中,4000rpm室温离心1min;然后用移液 枪小心的将上清液吸掉800吐,剩下的液体和离心管底部的固体用移液枪轻轻吹 打混匀;

(7)  取混匀后的菌液100吐滴到含有Kana抗性的LB固体培养基上,所加入的 卡那霉素的浓度为50卩g/ml,然后用玻璃刮铲涂匀;

(8)  37C倒置培养过夜(最好前一天晚上涂完平板培养过夜,第二天看是否长 菌斑);

(8)   挑取单菌落分别接种与10ml含有AMP的LB培养基内(AMP浓度为100

Ug/ml) , 37C培养14h,然后用康为世纪的质粒抽提试剂盒对转化后的质粒进 行抽提,抽提步骤参见试剂盒说明书;抽提后的质粒要进行一代测序验证和酶切 验证;

(9)   最后对验证正确的阳性菌液进行分装保存,分装的时候往500yL的菌液中 加50%甘油500yL,液氮速冻,-80C冰箱保存备用。 注:以上的所有操作均在超净工作台里进行。

5、  目的片段与pMN530-G/P表达载体进行连接获得pMN53O-TCC6-G/P亚细胞定 位载体,具体过程如下:

用BglII和Kpn I两种限制酶对步骤4中验证正确的阳性质粒和pM0N530-GFP 空载进行双酶切,然后用T4连接酶连接。

双酶切体系(50yL): 37C, 2. 5h

BglI

2. 5yL

KpnI

2. 5yL

Buffer(1xT)

5yL

质粒

22yL

H2O

18吐

 T4连接酶连接体系(10):16C过夜连接

4.2.3   感受态细胞的制备

本实验需要用到大肠杆菌DH5 a和农杆菌EHA105的感受态细胞,其制备过 程如下:

(1)  取相应的大肠杆菌或农杆菌的菌液用接种环接种到相应的固体培养基上, 倒扣培养待其长出单克隆菌落;

(2)  挑取单克隆菌落放入 50ml 的液体培养基中(液体培养基用 100ml 三角锥形 瓶装),200rpm恒温摇床过夜培养;

(3)  待菌液摇起来后取1 ml加入到50ml新鲜的液体培养基中,200rpm摇床培 养3-4h (让菌液的OD600=O.5左右);

(4)  取1. 4ml的菌液到2. 0ml的EP管中(一般做15管的感受态细胞),冰浴 30min;

(5)   4C, 4000rpm,离心10min,然后弃上清;

(6)   加入400吐,预先冰浴的0. 1MCaCl2溶液(1. 11gCaCl2+H2O,定容到100ml), 轻轻吹打混匀,再冰浴 30min;

(7)   4C, 4000rpm,离心10min,然后弃上清;

(8)  加200^L预先冰浴的0.1MCaCl2溶液,用移液枪小心的吹打混匀,然后加 入60吐的50%甘油,液氮速冻放-80C超低温冰箱保存备用。

注:大肠杆菌DH5 a用的是LB培养基,其培养环境为37C ;农杆菌EHA105用的 是YEB培养基,YEB培养基需加利福平(100mlYEB培养基+75yL利福平),其培 养环境为 28C。

4.  2. 4   亲本的组织培养和遗传转化

1、水稻种子的消毒处理:

(1)   将tcd6亲本种子脫壳,37C烘箱烘3天;

(2)   将烘干后的种子倒入经高压蒸汽灭过菌的锥形瓶中,无菌水清洗2 次;

(3)  用75%乙醇50ml对种子进行1min消毒,期间放置在200rpm, 28C摇床上, 然后用无菌水清洗3 次;

(4)  用加入TW20的25%次氯酸钠溶液100ml (每100ml加入6滴TWJ摇床处理 30min,处理两次(每次处理结束后均用无菌水洗涤3次,摇床转速为200rpm);

(5)     最后用无菌水洗涤多次( 需要 2000ml 无菌水),每次洗涤摇床转速为 200rpm,摇 10min。

2、 愈伤组织的诱导与继代培养:

(1)  在超净台中将消毒洗涤好的种子播种到含诱导培养基的培养皿中(MS培养 基),培养基中加入氨苄青霉素;

(2)   将培养皿封好口,28°C避光正放,培养14天;

(3)   等到培养皿里的种子长出小的黄色的细胞团后,用镊子将这些小的细胞团 小心剥下,然后放到含有继代培养基的培养皿中(用的是MS培养基),28C黑 暗培养 14 天;

(4)   共继代 3 次,每次培养两周。

3、 含有pCAMBIA1301-TCD6质粒的农杆菌培养:

(1)   在农杆菌侵染实验前2天,将含有pCAMBIA1301-TCD6质粒的农杆菌划线活 化,用的是YEB固体培养基(培养基中含有Kana和利福平);

注:pCAMBIA1301-TCD6质粒转农杆菌感受态的步骤参照亚细胞定位载体转大肠 杆菌感受态的步骤。

(2)   用药勺刮一勺活化的农杆菌到100ml灭过菌的AAm溶液中,调节ODe。。至 0. 125, 200rpm, 28C 摇床处理 15min。

4、 农杆菌侵染:

(1)  将长到一定大小的愈伤组织挑出,放到已调好OD600值的菌液中,200rpm, 28C摇床摇15min;

(2)   将侵染后的愈伤组织取出,置于无菌滤纸上晾干60min;

(3)  将晾干后的愈伤组织用镊子夹取放到表面铺有小滤纸的含有共培养培养基 的培养皿中,26C黑暗下培养3天。

5、 抗性愈伤组织的筛选:

第一次筛选(用的是加入头抱cef/car和潮霉素的筛选培养基,其中头抱cef/car 浓度为3ml/L,潮霉素1ml/L):

(1)  将农杆菌侵染后的愈伤组织用无菌水清洗(洗6瓶水,每瓶500ml),每 次清洗的时候先用50ml无菌水洗4次,倒掉无菌水后加入20ml含cef的无菌水(每400ml无菌水加入头抱3ml),摇床处理5min;

(2)   将清洗后的愈伤组织倒在滤纸上,吸干多余的水分,晾60min左右;

(3)  将晾干后的愈伤组织转移到含有筛选培养基的培养皿中,避光培养10-14 天,期间视情况而定,若发现有污染,应尽早进行下一步。

第二次筛选: 将第一次筛选过的存活的愈伤组织转移到含有新鲜筛选培养基的培养皿中, 避光培养10 天左右。

6、 抗性愈伤组织的预分化:

在超净工作台中挑取筛选过后颜色鲜黄的抗性愈伤组织,转移到含有预分化 培养基的培养皿中,28°C避光培养7天左右。

7、 抗性愈伤组织的分化:

将经过预分化的愈伤组织放入到含有分化培养基的分化罐中(每一罐放3-4 颗愈伤组织),28C条件下放置4-6周;期间每隔两周检查分化培养基情况,及 时更换培养基;待出苗后,转移到生根培养基中壮苗生根。

注:以上步骤1 至步骤7 均在超净工作台中操作,要严格遵守无菌操作流程。

8、 转基因植株的表型鉴定:

对比空载侵染的tcd6亲本,挑选生根罐中表型与野生型一致的植株,剪取 其叶片提取DNA, PCR扩增测定潮霉素基因以及进行测序比对,潮霉素阳性检测 及测序比对所用到的引物序列如下:

YZ-F                           5' ACTGGATGCCAACCAAGAACT 3'

YZ-R                           5'AGAGAGGACTGAAAGGAATGTTG 3'

HPT-F                        5'GATGTTGGCGACCTCGTATT 3'

HPT-R                        5'GTGTCACGTTGCAAGACCTG 3'

4.2.5 烟草原生质体的提取与转化实验

1、提取试剂的配置:

在提取前,先准备好28C的摇床和37C的水浴锅,然后根据以下配方配置 试剂:

(1)酶解液的配置(20ml,现配现用):

甘露醇(Mannitol)

2.186g

纤维素酶(Cellulase)

0.3g

果胶酶(Pectinase)

0.15g

0.4M MES (pH 5.7)

500yL

以上试剂依次在小烧杯中搅拌溶解,溶解温度为37C, 30min (期间每隔10min 搅拌晃动一次),待全部溶解后加入下列试剂

10% BSA

200yL

1M CaCl2

68吐

P -ME

7yL

0.1g/ml Amp

20yL

 

定容至20ml,过滤除菌备用(由于P -ME具有刺激性气味,故以上试剂在配置过程中应在通风橱中进行)。

(2)     重悬液 W5 和 MMG 的配置: 

(3)   40%PEG 溶液的配置(10ml):

2、 烟草原生质体的提取:

(1)   剪取较幼嫩的烟草叶片2-3片,将其剪碎放入到内径2. 5cm的大试管中, 加入酶解液,包上锡箔纸,28C酶解5h;

(2)   将酶解后的液体通过孔径为70卩m的微孔滤膜进行过滤,借助玻璃棒将滤 液引流至10ml圆底离心管中,1000rpm,升降速为1,室温离心3min;

(3)  小心倒掉上清,然后加入等体积的W5溶液,轻轻摇晃,1000rpm,升降速 为 1,室温离心 3min;

(4)  小心去上清,加入150yL*N MMG溶液(N为后续试验准备分装的管数), 轻轻颠倒混匀;

3、 质粒转烟草原生质体:

(1)   将150吐的烟草原生质体和50yLpMON530-TCD6-GFP质粒混合放入10ml圆 底离心管中,然后加入200yL的40%PEG溶液,小心轻晃,28C避光处理15min;

(2)   加入4ml的W5溶液,轻轻混匀,1000rpm,升降速为1,离心3min;

(3)   倒掉上清液,加入1.8mlW5溶液,28C避光处理14h;

(4)   1000rpm,升降速为1,离心3min,去除大部分上清,留50yL观察拍照记 录。

4.2.6力06基因系统进化树与组织特异性分析

通过 NCBI 网站,输入 TCD6 蛋白序列查找与其同源的蛋白序列,然后利用 MEGA7.0 软件构建 TCD6 蛋白的系统发育树, 构建过程中 方法参数选用 "Neighbor-Joining"和 “ 1000 bootstrap replicates"。

为了研究TC6基因在水稻各组织中的表达情况,我们分别提取了自然环境 下生长的野生型''嘉花1号”成熟植株中的根(Root)、茎(Stem)、倒二叶(Thesecond leaf from the top, SL)、剑叶(Flag leaf at heading, ¥L\、穗(Panicles,PN)的总RNA以及野生型“嘉花1号”幼苗中的第3叶、第4叶、第5叶的总RNA,并反转录为cDNA,以OsActin基因(L0C_0s03g50885)作为内参基因,运用qRT-PCR技术研究TCD6基因在水稻各组织中的表达情况°qPCR引物序列如下:

4.2.7 水稻叶绿体转录本的剪接和编辑分析

分别提取32C下野生型“嘉花1号”和tcd6亲本幼苗的第3叶、第5叶总RNA并反转录为cDNA。根据文献[78],采用RT-PCR技术,以cDNA为模板,使用内 含子两侧特定的引物,对水稻15 个叶绿体基因的转录本进行剪接分析,引物序 列如表4-1 所示。水稻叶绿体基因组编辑位点的分析采用的是一代测序的方法, 即先用南京诺唯赞公司提供的P55-d1/d2/d3系列的高保真酶,以32C条件下 野生型和tcd6亲本幼苗的第3叶、第5叶的cDNA为模板扩增出水稻叶绿体基因 组可能存在编辑的基因,PCR产物切胶回收后送华大基因进行测序分析。PCR反 应过程及反应体系见第3 章所述,所用到的引物序列如表4-2 所示。

表 4-1 用于叶绿体转录本剪接分析的引物

4.2.8 &〃6突变体中力06基因及其相关基因的表达分析

用qRT-PCR的方法分析相对基因的表达,qPCR反应体系用的是SYBRR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液体系。仪器用的是ABI Wuantstudio 6 Flex实时PCR系统。反应模板用的是32C条件下野生型“嘉花1 号”和tcd6亲本幼苗的第3叶、第5叶的cDNA。扩增程序如下:95C持续10min, 接着是95C、15sec; 60C、1min;循环40次。用2-AACT法販分析相对基因的表 达,以OsActin基因(LOC_Os03g50885)作为内参基因,引物如表4-3所示。

表4-3 相关基因表达量分析所用到的引物

rbcL                 5'-CTTGGCAGCATTCCGAGTAA-3'

psaA            5'-GCGAGCAAATAAAACACCTTTC-3'

psaB              5'-GAGCAATATCGGTCAGCCACA-3'

psbA              5'-CCCTCATTAGCAGATTCGTTTT-3'

rpoA                 5'-GTGGAAGTGTGTTGAATCAA-3'

rpoC1               5'-ATTAGACGCATGCAATTGGC-3'

rpoC2           5'-CAATTTACGCGAGGGACTTTCT-3'

rpoB                    5'-TTTGGTTTCGATGTGCA-3'

4.3  结果与分析

4.3.1 转基因互补植株的获得与检测

为了验证图位克隆的正确性,证明tcd6突变体的表型变化就是由TCD6基因 突变引起的,我们用同源重组克隆的方法构建了 pCAMBIA1301-TCD6全基因组的 互补表达载体,构建示意图如图 4-1 所示。互补表达载体测序验证正确后,通过 农杆菌转化法,将互补表达载体转入到tcd6亲本愈伤组织中,同时设置空白对 照,经过一系列的播种、拔芽、继代、侵染、筛选、分化等组织培养过程(图 4-2),最终获得了 T。代互补转基因苗。对T。代转基因苗的表型观察发现,空白 对照组的愈伤组织在28C下长出的幼苗呈现白化表型,与tcd6亲本表型一致; 而转入互补表达载体的愈伤组织在28C下萌发的幼苗与野生型一致,呈现出正 常的绿色表型(图4-3)。对T。代绿色表型植株进行潮霉素检测,并对潮霉素检 测阳性的植株进行TCD6基因的测序验证,结果发现tcd6亲本基因的突变位点处 出现了 “A/T”双峰,表明在T。代转基因互补苗中存在正常的TCD6基因(图4-3)。

将上述T。代转基因苗移栽到上海师范大学植物园的温室内培养,使其自交获 得种子,然后将种子播种于温室内获得h代植株,对h代植株苗期表型观察统 计发现其出现明显的性状分离现象。以上结果证明,tcd6突变体苗期白化表型 就是由TCD6基因(L0C_0s06g02200)单碱基突变造成的。

image.png

图4-1 pCAMBIA1301-TCD6互补表达载体构建示意图

(A):同源重组克隆原理示意图;(B) :pCAMBIA1301-TCD6互补表达载体示意图; (C) :pCAMBIA1301-TCD6互补表达载体酶切验证电泳图(目的基因长度约为5000bp, pCAMBIA1301线性片段长度约为10000bp)。

image.png

图4-3互补T。代转基因苗表型图及验证

(A):互补T。代转基因苗表型图(注:空白对照组是将pCAMBIA1301空载转入到tcd6突变 体亲本中得到的);(B):互补T°代转基因苗潮霉素阳性验证;(C):互补T0代转基因 苗测序验证突变位点岀现双峰,表明TCD6正常基因的存在。

4.3.2  TCD6 蛋白亚细胞定位于叶绿体上

通过NCBI网站查找分析发现TCD6基因编码一个PPR蛋白,该PPR蛋白由 14个PPR基序组成,含有典型的DYW基序和叶绿体转运肽。为了研究TCD6蛋白 是否定位于叶绿体,我们设计了特异性引物,并PCR扩增了包含TCD6基因信号 肽及起始密码子在内的cDNA片段,全长为453bp,卞构建了 pMON53O-TCD6-GFP亚 细胞定位瞬时表达载体(图4-4A)。然后我们将构建好的瞬时表达载体转入到 烟草原生质体中,通过荧光共聚焦显微镜观察发现,GFP蛋白所发出的绿色荧光 与叶绿体自身发出的红色荧光完全融合(图4-4 B)。由以上观察的结果可知, TCD6基因所编码的TCD6蛋白定位在叶绿体上,表明TCD6蛋白是叶绿体上的蛋 白,与叶绿体的生长发育有关。

image.png

图 4-4 TCD6 蛋白亚细胞定位分析图

(A) : pMON530-TCD6-GFP亚细胞定位载体构建示意图;(B) : TCD6蛋白在烟草原生质体 中的亚细胞定位。GFP (green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)。

4.3.3  TCD6 蛋白的系统进化树分析

互补实验证明了 tcd6突变体的表型变化确实是由TCD6基因突变导致的。通 过 NCBI 网站查找(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi7PR0GRAM),该基因 编码的TCD6蛋白在拟南芥中的同源蛋白是CRR22。氨基酸序列比对发现,TCD6 蛋白与拟南芥中的同源蛋白 CRR22 虽然仅具有57.7%的氨基酸序列同源性(图 4-5),但其C-末端的保守序列确一致。由此说明,该PPR蛋白在植物进化过程 中,扮演着一个重要角色。从系统发育树也可以看出,与 TCD6 同源的蛋白质在 陆地植物中广泛分布(图4-6),无论是单子叶植物,如水稻(Rice)、玉米(Zea mays) >大麦(Hordeum vulgare)等,还是双子叶植物,如拟南芥(A)、木薯 (Manihot esculenta)等,该类蛋白的进化同源性都很高,表明该PPR蛋白是陆 地植物生长的必需蛋白。

有趣的是,在拟南芥中与TCD6基因同源的突变体crr22 (同源基因 At1g11290)确没有表现出明显的叶色表型时。这可能是与其氨基酸序列同源性 仅为 57.7%有关,并且水稻作为单子叶植物与双子叶植物的拟南芥属于不同的种 属,这也是造成其叶色表型变化不一致的原因。由此说明,该PPR蛋白在水稻和 拟南芥不同物种中扮演了不同的角色。

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图 4-5 TCD6 蛋白与 CRR22 蛋白氨基酸序列比对分析

通过NCBI网站,输入TCD6蛋白的氨基酸序列查找与其同源的蛋白序列,然 后利用 MEGA7.0 软件构建 TCD6 蛋白的系统发育树,构建过程中方法参数选用 “Neighbor-Joining” 和 “ 1000 bootstrap replicates” ,粳稻组用黑点突出表示(图 4-6)。

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图 4-6 TCD6 蛋白的系统发育树分析

4.3.4          基因的组织特异性表达

为了研究TCD6基因在水稻各组织中的表达情况以及在tcd6突变体中白化的 第3 叶和绿色的第5 叶中的表达情况,我们分别提取了自然环境下生长的野生型 “嘉花1号”成熟植株中的根(Root, R)、茎(Stem, S)、倒二叶(The second leaf from the top, SL)、剑叶(Flag leaf at heading, FL)、穗(Panicles, PN) 的总RNA以及野生型“嘉花1号”幼苗和tcd6亲本幼苗中的第3叶、第4叶、 第5叶的总RNA,并反转录为cDNA,以OsActin基因(LOC~Os03g50885)作为内 参基因,运用qRT-PCR技术研究了 TCD6基因在水稻各组织中的表达情况。

结果显示,TCD6基因在水稻根、茎、3叶、4叶、5叶、倒二叶、剑叶、穗 中均有表达,其中在野生型水稻苗期的第3 叶、第4叶中的表达量最高,而在野 生型第5叶中的表达量下调(图4-7 C);在tcd6突变体中,TCD6基因在白化

第3叶中的表达量明显高于绿色第5叶中的表达量(图4-7 B)。基于TCD6基 因在野生型水稻各组织中的表达量结果,我们可以发现其在幼叶中即第 3叶、第 4叶的表达量最高,表明,TCD6基因是水稻苗期幼叶生长发育的重要基因。而在 突变体tcd6中,TCD6突变基因的表达也印证了 TCD6基因在幼苗四叶期前扮演 了一个重要的角色。因为,TCD6基因是幼苗四叶期前叶片生长发育的重要基因, 所以当其发生突变后,其表达产物丧失功能,反馈给植物本身,使TCD6基因大 量表达,期望获得有功能的产物。

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         4.3.5力少基因参与叶绿体基因的剪接与编辑

在拟南芥中,与TCD6同源的蛋白CRR22 (由At1g11290编码)被证明是编 辑拟南芥中ndhB-746、ndhD-887和rpoB-551位点所必需的[87];与CRR22相似, TCD6是一种典型的DYW型PPR蛋白,也可能参与细胞器RNA的剪接与编辑。因 此,我们分别提取了 32°C条件下野生型“嘉花1号”和tcd6突变体第3叶、第 5叶的总RNA并反转录为cDNA,利用RT-PCR技术对水稻15个叶绿体转录本进行 剪接分析。电泳结果显示,tcd6突变体白化第3叶中的ndhA基因存在RNA剪接 缺陷,而在绿色第 5 叶中表现正常,其他14个叶绿体转录本无论是第 3叶还是第 5 叶都正常剪接(图 4-8)。

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图4-8水稻(Oryza sativa) WT和tcd6突变体3叶期第3叶、5叶期第5叶叶绿体转录本的 剪接分析。用RT-PCR方法比较了剪接效率。左边标的是基因名称,右边标记的是剪接(S) 和未剪接(U)的转录本。

然后我们对水稻叶绿体基因组中可能存在的 11 个编辑位点进行一代测序分 析。根据各基因可能出现的编辑位点,在其两端处设计相应的特异性引物,分别 对WT和tcd6突变体中的第3叶、第5叶进行一代测序分析。序列比对结果显示, 只有ndhA基因出现了明显的编辑缺陷(图4-9)。在tcd6突变体白化的第3叶 中未被剪接的ndhA转录本在473位存在明显的编辑缺陷(图4-9 C左);而 tcd6亲本绿色的第5叶中未被剪接的ndhA转录本在473位编辑效率恢复,并且 在剪接的ndhA转录本中其编辑作用与野生型一致(图4-9 C右)。

综合以上结果,TCD6基因的突变影响水稻幼苗五叶期前的叶片发育过程中 ndhA基因转录本的剪接与编辑;而在五叶期后的叶片发育中,TCD6基因的影响减弱,推测可能存在另一个未知的PPR蛋白作用于ndA基因,使ndA基因转录 本的剪接与编辑恢复正常。

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图4-9野生型(WT)和tcd6突变体第3叶、第5叶中ndA基因转录本的RT-PCR分析以及 ndhA-473位的测序峰图

(A):灰色框表示两个外显子的ndhA基因的结构以及在(B)中所使用的引物位置;(B): 野生型(WT)和tcd6突变体第3叶、第5叶中ndhA基因转录本的RT-PCR分析;剪接的转 录本长度约为1100bp,未剪接的转录本长度约为1956bp;      (C):野生型(WT)和tcd6突变体第3叶、第5叶ndhA基因未剪接转录本和剪接转录本中473位的测序峰图。

4.3.6           亲本中PEP、NEP相关基因的表达

为了探究TCD6基因的突变影响了水稻叶绿体发育的哪一过程,我们利用 qRT-PCR技术分别分析了 32°C条件下野生型“嘉花1号”和tcd6突变体第3叶、 第5 叶中与叶绿体生长发育相关的 rbcL、psaA、psaB、psbA、rpoA、rpoB、rpoC1 和rpoC2基因的表达量。结果显示,tcd6突变体白化的第3叶中依赖质体编码 的RNA聚合酶(PEP)转录的基因rbcL、psaA、psaB、psbA的表达量相较与野生 型明显下调,有趣的是,绿色的第5叶中依赖质体编码的RNA聚合酶(PEP)转 录的基因的表达量几乎完全恢复,与野生型相似(图4-10 A、C);而依赖核基 因编码的RNA聚合酶(NEP)转录的基因roB、rpoC1、roC2无论是在白化的第 3叶中,还是绿色的第5 叶中,其表达量相较与野生型均出现明显的上调(图 4-10 B、D)。

在第一章绪论中已经提到,叶绿体的生长发育过程涉及到三个阶段,其中 rbcL、psaA、psaB、psbA基因的表达与光合系统的形成有关,这些基因均由质 体编码的RNA聚合酶转录,而rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2基因则参与质体编码 的RNA聚合酶亚基的形成。以上基因的表达结果显示,tcd6突变体白化的第3

叶中由于rbcL、psaA、psaB、psbA基因的表达明显下调,使光合系统的形成受 阻,影响叶片的光合作用,从而使叶片白化。同时,由于植物本身的反馈调节作 用,依赖PEP转录的基因表达量下降,使植物误认为PEP活性下降或PEP数量不 足,从而导致与PEP亚基形成相关的zpoB、rpoC1、r>oC2基因表达量上升。

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图4-10水稻(Oryza sativa)野生型(WT)与tcd6突变体第3叶、第5叶中质体编码RNA 聚合酶(PEP)依赖基因和核编码RNA聚合酶(NEP)依赖基因的转录积累分析。

(A):三叶期WT和tcd6叶片中PEP依赖基因的表达分析;(B):三叶期WT和tcd6叶片 中NEP依赖基因的表达分析;(C):五叶期WT和tcd6叶片中PEP依赖基因的表达分析;

(D):五叶期WT和tcd6叶片中NEP依赖基因的表达分析

4.4  小结

通过前两章的研究,我们已经拿到了一个特殊的水稻叶色突变体tcd6,并 克隆到了影响突变性状的目标基因TCD6,转基因互补实验证明了 TCD6基因的突 变就是引起tcd6突变体特殊叶色表型的原因。TCD6基因编码一个含有14个PPR 基序的PPR蛋白,亚细胞定位显示,该基因编码的蛋白定位在叶绿体上。前人已 经报道了许多叶绿体定位的PPR蛋白,如水稻中的0sPPR1测蛋白,该蛋白有810 个氨基酸,包含11个PPR基序,其功能缺陷导致水稻幼苗严重白化,影响叶片 的光合作用。水稻中另一个叶绿体定位的OsPPR3[77]蛋白,其功能缺陷导致水稻 幼苗四叶期前,叶片出现明显的白色条纹,四叶期后所长出的叶片恢复正常。以 上这些叶绿体定位蛋白的功能缺陷均造成明显的叶片白化表型,这与本实验的 TCD6蛋白类似,同时系统发育树显示,TCD6蛋白普遍存在于陆生植物中。由此 表明,编码该蛋白的TCD6基因能够影响水稻幼苗四叶期前叶片的生长发育,是 水稻早期叶片发育的必需基因,这也与TCD6基因在野生型及突变体tcd6组织中 的表达结果相吻合。

作为含有自身基因组DNA并且有一定自主权的叶绿体,其生长发育不仅需要 核编码的基因进行调控,而且还需要质体编码的基因进行调控。在第一章绪论中 已经提到,叶绿体作为光合作用的场所,其生长发育过程可分为三个阶段[4],第 一阶段涉及质体复制的激活和质体DNA的合成;第二阶段也叫做叶绿体的积累阶 段,其特征是建立叶绿体的遗传体系。在这一阶段,核编码的质体RNA聚合酶(被 称为NEP)优先转录与编码质体基因表达机制有关的基因,叶绿体的转录和翻译 活性在这一阶段也显著增加。第三阶段,编码光合装置的质体基因和核基因以非 常高的水平表达,其中,与光合装置有关的质体基因主要由质体编码的RNA聚合 酶转录(被称为PEP)。在以上叶绿体的生长发育过程中,与第二阶段有关的基 因有rpoA、rpoB、rpoC1和rpoC2,这些基因的转录与否,直接影响质体编码的 RNA聚合酶亚基的形成"痕。而与第三阶段有关的基因包括rbcL psaA、psaB和 psbA,这些基因均与光合作用的过程有关,其转录与否,直接影响光合系统的形 成[93][94]o在本章的研究中,已经证明了 tcd6突变体白化的第3叶中rbcL、psaA、 psaB、psbA基因的表达量相较于野生型出现明显的下调,而rpoA、rpoB、rpoC1、 roC2基因相较于野生型却表现出明显的上调。结合叶绿体生长发育的三个阶段 分析,TCD6基因的突变影响了幼苗第3叶中叶绿体生长发育的第三阶段,使该 阶段的光合系统的形成受阻。同时,由于水稻自身的反馈调节,光合系统的无法 形成让水稻误认为PEP活性降低或PEP数量不足,从而导致合成PEP亚基的rpoA rpoB、rpoC1、roC2基因转录上调。

进一步研究发现,TCD6基因参与了水稻幼苗五叶期前叶片中质体基因ndhA 的剪接与RNA编辑。在tcd6突变体白化的第3叶中,ndhA基因的剪接存在缺陷, 同时,ndhA-473位的编辑缺失。ndhA基因,即NADH脫氢酶亚基I,参与光合作 用的过程。结合白化的第3叶中依赖PEP转录的基因(参与光合系统的形成)的 表达量明显下调的数据,我们可以得到以下结论:TCD6基因的突变使得水稻幼 苗第3叶中的ndhA基因剪接与编辑缺陷,导致光合系统无法形成,不能进行光 合作用,从而影响叶绿体发育的第三阶段,最终导致叶片白化。

第5 章 总结与讨论

在本研究中,我们发现并鉴定了苗期叶片白化突变体tcd6,其特征是在水 稻幼苗发育过程中,三叶期前叶绿素的合成以及叶绿体的发育遭到不同程度的破 坏导致白化叶片的出现;待幼苗生长到四叶期时,叶绿体的发育及叶绿素的合成 逐步恢复;等到其长到第 5 叶时,叶绿素含量、叶绿体发育以及叶色表型均恢复 到与野生型一致的水平。通过图位克隆技术,我们克隆到了 TCD6基因并且确定 该基因编码的蛋白是一个叶绿体定位的PLS-DYW型亚家族PPR蛋白。由于TCD6 基因的突变使TCD6蛋白的翻译提前终止,从而导致水稻幼苗发育过程中二叶期、 三叶期出现明显的叶片白化现象,并使依赖PEP转录的基因的表达量降低,从而 影响叶绿体发育的第三阶段。本研究表明,水稻TCD6基因是水稻幼苗生长过程 中五叶期前叶绿体生长发育的必需基因。

5. 1 %%基因是水稻幼苗五叶期前叶片中叶绿体生长发育所必 需的水稻幼苗的生长,从种子萌发到成熟叶片的形成要经过完全由胚乳提供营养 的异养阶段到完全自养阶段,王万里等人将这一过程细分为 3 个阶段[95],首先, 从种子萌发到第 1 叶不完全叶的长成称为异养阶段,在这一阶段,种子萌发所需 要的所有营养均由胚乳提供;其次,从第 1 叶露心开始到胚乳营养全部耗尽称为 异养到自养的过渡阶段,在这一阶段由于第 1 叶的长成,水稻幼苗开始能够进行 光合作用,但其光合作用速率与呼吸作用速率相比仍较低。因此,在这一阶段, 异养和自养同时存在。最后一阶段是胚乳营养完全耗尽后,幼苗生长所需的营养 全部来自光合作用及周围环境,被称为完全自养阶段。水稻幼苗一般生长到 3叶 期后,便进入到了完全自养阶段。

本研究得到的水稻特殊叶色突变体tcd6,其幼苗在生长过程中二叶期、三 叶期长出明显的白化叶片,四叶期后逐渐恢复,长出的叶片与野生型基本一致。 通过图位克隆技术,我们成功克隆到了引起突变体叶片表型变化的基因是水稻6 号染色体上的TCD6基因(L0C_0s06g02200)。结合水稻幼苗生长阶段的分析, 我们可以看到,TCC6基因的突变主要影响幼苗生长的异养到自养的过渡阶段, 即二叶期、三叶期的生长。同时,亚细胞定位分析显示,TCD6基因编码的TCD6 蛋白定位在叶绿体上。据文献报道,叶绿体的生长发育大体可分为三个阶段[4], 第一阶段为质体复制的激活及质体DNA的合成;第二阶段主要是叶绿体开始积 累,在此阶段依赖NEP转录的基因开始表达,来合成PEP亚基;第三阶段主要是 光合系统的形成阶段,在此阶段依赖PEP转录的基因开始表达,来合成光合系统 装置。其中,在叶绿体发育的第二阶段用来合成PEP亚基的主要基因有rpoA rpoB、rpoC1和rpoC2[7][8],这些基因的转录与否直接影响了 PEP的合成。而在叶 绿体发育的第三阶段,与光合系统装置形成有关的基因有rbcL、psaA、psaB和 psbA^,这些基因的好坏直接关系到叶绿体能否进行光合作用。上述基因在 tcd6突变体中的表达结果显示(图4-10), tcd6突变体白化的第3叶中rbcL、 psaA、psaB和psbA基因的表达量相较于野生型明显下调,而rpoA、rpoB、rpoC1 和roC2基因的表达量相较于野生型出现上调。通过这一结果,我们可以看出, tcd6突变体白化的第3叶中,由于TCD6基因的突变导致了参与光合系统形成的 基因的表达量下调,影响了叶绿体发育的第三阶段。其中,因为依赖PEP转录的 基因表达量下降,让水稻幼苗误认为PEP活性不足或数量下降,使参与PEP亚基 形成的基因高表达,这与本实验测得的结果相吻合。

系统发育树分析表明,TCD6的同源蛋白在陆地植物中普遍存在,说明该类 蛋白是植物生长发育过程中的必需蛋白。进一步研究发现,TCD6基因在水稻幼 苗3叶、4叶中高表达,5叶及成熟叶中的表达量不高。这也说明了,TCD6基因 主要在幼苗生长的 5 叶期前起作用。结合上述叶绿体发育阶段的分析,我们可以 得出以下结论:TCD6基因参与了水稻幼苗5叶期前的生长过程,当其发生突变 时,影响了幼苗叶片中叶绿体发育的第三阶段,阻碍了光合装置的形成。同时, 二、三叶期是水稻幼苗由异养到自养的过渡时期,该时期胚乳还能提供幼苗生长 所需的营养,所以即使叶片光合作用效率弱,幼苗仍能够生长。待长到四、五叶 期后,胚乳营养耗尽,幼苗生长进入完全自养阶段,并且TCD6基因的作用减弱, 叶片需要光合作用,因此,四、五叶期后,叶绿体发育逐渐正常,叶片转绿。

5. 2 TCD6蛋白参与了水稻幼苗四叶期前的叶绿体转录本ndhA的 剪接和ndhA-473位点的编辑

TCD6蛋白由734个氨基酸组成,包含14个PPR基序,是一个典型的PLS-DYW 型PPR蛋白。正如前面章节所述,PLS型类PPR蛋白在RNA编辑中通常作为位点 特异性因子发挥作用阿。如拟南芥中的CRR28蛋白[96],该蛋白由Atlg59720基因 编码,是典型的DYW型PPR蛋白,对拟南芥中的ndhB、ndhD基因有编辑作用。 再比如水稻中的0sATP4蛋白[51],该蛋白能够编辑水稻中rps8转录本的特定核苷 酸。0sATP4蛋白功能的缺失,能够导致20C条件下生长的水稻幼苗出现明显的 白色叶片。氨基酸同源序列比对发现,拟南芥中与TCD6蛋白同源的蛋白是CRR22 蛋白。拟南芥作为一种模式植物,目前研究的比较透彻,通过查找文献发现,CRR22 蛋白(由At1g11290编码)在拟南芥中参与编辑ndhB-746、ndhD-887和rpoB-551 这几个基因位点[87]。有趣的是,经过研究分析,水稻中的 TCD6 蛋白在幼苗的三 叶期只参与ndhA-473位点的剪接与编辑,这与拟南芥中的同源蛋白有所不同。 并且,在拟南芥中,CRR22蛋白功能的缺陷不会引起拟南芥叶片表型的变化,而 水稻中TCD6蛋白的功能缺失却能使幼苗叶片显著白化。两者之间的差异可能是 由于水稻与拟南芥属于不同的种属,基因在表达上存在物种上的差异。并且,从 TCD6 蛋白与 CRR22 蛋白的氨基酸序列比对结果也可以看出(图 4-5),两者仅有 57.7%的氨基酸相似,这也可能是造成两者差异的原因。

叶绿体NADH脫氢酶(NDH)复合物是通过调节类囊体膜中铁氧还原蛋白依赖 性灰质喹酮的减少,参与光合作用的光反应过程[91]。而NdhA是一种具有跨膜螺 旋的膜嵌入式亚基,在NDH复合体的亚A和亚M之间的连接处充当PQ门户蹈。 水稻中报道的参与ndA基因剪接与编辑的PPR蛋白有2 个,分别是0sPPR4蛋白 两和0sSLA4蛋白妙。0sPPR4蛋白(由0s04g0684500基因编码)属于P家族的 PPR蛋白,其功能缺陷使突变体幼苗白化致死。OsPPR4蛋白参与atpF、ndhA、 rpl2、rps12-2、petB和ips"基因内含子的剪接。此外,在osppr4突变体中, 未剪接的ndA转录本的RNA编辑下降,而在WT植物中,剪接和未剪接的ndA 都被完全编辑。0sSLA4蛋白是由0s07g0172600基因编码的,属于DYW型的PPR 蛋白,该蛋白的突变体sla4从发芽到第3叶阶段叶片一直表现出白化现象,然 后逐渐死亡。 0sSLA4 蛋白功能的缺失能够导致 atpF,ndhA,petB,rpl2,rpl16, rps12-2以及trnG内含子剪接严重缺陷。与以上所列的水稻中两PPR蛋白类似, TCD6蛋白也参与水稻幼苗三叶期叶片中ndA基因的剪接与RNA编辑,不同的是, TCD6蛋白只在五叶期前的白化叶中参与ndA基因的剪接与编辑,五叶期及以后, 突变体tcd6叶片中的ndA基因的剪接与编辑缺陷恢复。猜测,可能存在另一个 PPR蛋白在水稻五叶期后发挥主要作用,纠正了 tcd6突变体中的ndA基因的剪 接缺陷。

TCD6蛋白、0sPPR4蛋白及0sSLA4蛋白三者的氨基酸序列比对结果显示,三 者的序列相似性很低(图5-1)。目前水稻中关于TCD6基因的等位基因或同源 关系很近的基因还未被报道。至于在tcd6突变体中,五叶期以后的叶片ndA基 因的剪接与编辑缺陷恢复的机制,还不是很清楚,目前仅猜测可能是存在另一个 PPR蛋白在五叶期及以后起主要作用或者存在一个与TCD6蛋白相互作用的蛋白, 该相互作用的蛋白主要在幼苗叶片发育后期起作用。以上的这些猜测有待于更深 一步的实验进行验证。

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结合上述分析我们可以得出以下结论:在tcd6突变体幼苗五叶期前的叶片 中由于ndhA基因的剪接与编辑存在缺陷,使得光电子的传递受影响,光合作用 速率下降,从而导致叶绿体发育受损,最终使幼苗五叶期前的叶片白化;而在幼 苗5叶期及以后的叶片中,突变体ndhA基因的剪接与编辑缺陷得到恢复,使其 叶片颜色恢复至正常表型。因此,TCD6基因在水稻幼苗五叶期前的叶片中参与 ndhA基因的剪接与RNA编辑,影响光合作用速率,进而影响了叶绿体的发育, 最终导致幼苗早期叶片绿色缺失。

5.3  总结

本研究证明了 TCD6基因是水稻幼苗早期叶片生长发育的必需基因,在这一 阶段,水稻幼苗的发育正处于由异养到自养的过渡时期,胚乳中的营养还未消耗 殆尽,同时,长出的第1 叶、第 2 叶又能进行光合作用。这一时期就需要 TCD6 基因的调控,促进叶绿体的发育,加快幼苗生长。而当TCD6基因的功能丧失时, 便会影响叶绿体发育过程中依赖PEP转录的基因表达,使叶绿体中的光系统无法 建立。同时,TCD6基因突变,导致其编码的TCD6蛋白功能丧失,使叶片中的质 体基因ndhA不能正常的剪接与编辑,影响光电子传递。以上的变化最终均会导 致光合作用速率严重下降,从而使叶片中的叶绿体发育异常,导致白色叶片的出 现。而当水稻幼苗发育进入到完全自养阶段,即四叶期后,由于TCD6基因作为
非必需基因,其对叶绿体发育的影响减弱,同时幼苗生长需要光合作用,叶绿体 开始正常发育。并且,在这一阶段,可能存在另一个未知的PPR蛋白作用于ndA 基因,使ndA基因转录本的剪接与RNA编辑恢复正常,从而使叶片发育恢复正 常。四叶期以后的叶片ndA基因的剪接与编辑缺陷恢复的机制,目前还不是很
清楚,需要接下来更深一步的实验进行验证。

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附录

水稻组织培养过程中所使用的各培养基的配方:

1、水稻种子播种和愈伤组织的继代培养基(MS培养基):

叫大量(20X)

50ml

叫微量(20X)

50ml

铁盐(100X)

10ml

有机(100X)

10ml

肌醇(100X)

10ml

酪蛋白(CH)

0.3g

脯氨酸

0.5g

谷氨酸

0.5g

2,4-D

1.5ml

蔗糖

30g

植物凝胶

2.5g



加入灭过菌的 ddH20 定容至 1000ml,

调 pH=5.78,

高压蒸汽灭菌备用



2、氨基酸培养基(AAm溶液)配方:

AA 大量(10X)

50ml

AA 微量(10X)

1ml

铁盐(100X)

10ml

有机(100X)

10ml

肌醇(100X)

10ml

酪蛋白(CH)

0.3g

蔗糖

68.5g

葡萄糖

36g

加入灭过菌的ddH20定容至1000ml,调pH=5. 2,高压蒸汽灭菌后加入乙酰丁香 酮(2ml/L)和氨基酸溶液(10X, 100ml/L)。

 

3、共培养培养基的配方:

叫大量(20X)

50ml

叫微量(20X)

50ml

铁盐(100X)

10ml

有机(100X)

10ml

肌醇(100X)

10ml

酪蛋白(CH)

0.5g

2,4-D

1ml

蔗糖

30g

葡萄糖

15g

植物凝胶

3g

加入灭过菌的ddH20定容至1000ml,调pH=5. 2,高压蒸汽灭菌后加入乙酰丁香 酮(2ml/L)。

 

4、筛选培养基的配方:

2,4-D              1ml          蔗糖 30g

植物凝胶           3.5g

加入灭过菌的dd^O定容至1000ml,调pH=5.8,高压蒸汽灭菌后加入潮霉素 (lml/L)和头抱霉素(3ml/L)或羧卞霉素(3ml/L)。

5、预分化培养基的配方:

MS 大量(20X)

50ml

MS 微量(100X)

10ml

铁盐(100X)

10ml

有机(100X)

10ml

肌醇(100X)

10ml

蔗糖

60g

植物凝胶

6g



加入灭过菌的 ddH2O 定容至 1000ml,

调pH=5. 8,高压蒸汽灭菌后加入细胞分裂

素6-苄基腺嘌吟(6-BA,   2ml/L)、

激动素(KT,   1ml/L)、

植物生长素萘乙酸

(NAA, 2ml/L)和头抱霉素(1ml/L)


6、分化培养基的配方:




MS 大量(20X)

50ml

MS 微量(100X)

10ml

铁盐(100X)

10ml

有机(100X)

10ml

肌醇(100X)

10ml

酪蛋白(CH)

0.3g

蔗糖

30g

植物凝胶

4.3g

加入灭过菌的 ddH2O 定容至 1000ml,

调pH=5. 8,高压蒸汽灭菌后加入细胞分裂

素6-苄基腺嘌吟(6-BA,   2ml/L)、

激动素(KT,   1ml/L)、

植物生长素萘乙酸

(NAA, 2ml/L)和头抱霉素(1ml/L)


7、生根培养基的配方:




MS 大量(20X)

25ml

有机(100X)

5ml

肌醇(100X)

5ml

蔗糖

10g

多硝唑

1ml

琼脂

10g

加入灭过菌的ddH2O定容至1000ml,调pH=5. 8,高压蒸汽灭菌后使用。

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