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水稻PPR基因的图位克隆与功能分析

作者:admin1 日期:2022-04-07 10:19:37 点击:314

摘要:叶绿体本身就携带遗传物质和遗传系统,但同时会受到核编码基因的调控。 然而,对植物叶绿体的生长发育过程中的调控机制还不是很清楚。本研究的材料 是水稻的粳稻品种“嘉花1号”经EMS化学诱变得到的苗期叶色白化突变体tcd6, 通过对其表型特征的观察、叶绿体发育分析、突变基因克隆、转基因互补、烟草 原生质体亚细胞定位及功能分析等,得到以下结论:

1、 不管是在高温(32°C)还是低温(20°C)条件下,tcd6突变体幼苗都表 现出绿色缺失表型,即二叶期、三叶期均表现出严重的叶片缺色,四叶期逐渐恢 复,五叶期的第5叶基本恢复至与野生型“嘉花1 号”一致的绿色正常表型。

2、 克隆得到了水稻中一个新的编码PPR蛋白的基因TCD6J LOC_0s06g02200), 该基因编码的蛋白包含14个PPR基序,是一个典型的DYW型蛋白,并通过互补 实验证明了 TCD6基因的缺陷是造成水稻突变体叶色表型变化的原因。

3、 光合色素含量测定及叶绿体显微电镜观察发现,tcd6突变体叶色缺失的 第3 叶中叶绿体发育严重缺陷,基粒片层缺失,出现空泡状结构,使得光合作用 相关的色素无法合成,最终导致叶片颜色白化。

4、 亚细胞定位发现,TCD6蛋白定位于叶绿体中,组织定位分析表明,TCD6 基因是水稻苗期叶片叶绿体发育早期的必需基因。

5、 TCD6基因参与调控水稻早期叶片中的PEP活性,TCD6基因的突变会使水 稻早期叶片中的PEP活性降低,从而影响叶绿体发育的第三阶段,最终导致早期 叶片发育过程中绿色缺失,出现白化现象。

6、   对水稻叶绿体转录本剪接分析发现,TCD6基因不仅参与水稻苗期叶片发 育早期质体基因力血4转录本的剪接,也参与了 mdA基因的RNA编辑。

关键词:水稻;TCD6;叶绿体;PPR蛋白;RNA剪接;RNA编辑

Abstract

The chloroplast has its own genetic material and system, but also regulated by nuclear genes. However, we do not know the regulatory mechanism of chloroplast growth and development in rice up to now. The object of this experiment is leaf color albino mutant tcd6, which was obtained by EMS chemical mutagenesis induced in japonica rice variety “Jiahua1”. By observing the phenotypic characteristics of tcd6 mutant, chloroplast development analysis, map cloning, gene complementarity, subcellular localization and functional analysis, we obtained the following conclusions:

1、   Whether at high temperature (32C ) or low temperature (20C ), tcd6 mutants showed distinct albino phenotypes in the two-leaf and three-leaf stages, and gradually recovered in the four-leaf stage. The fifth leaf in the five-leaf stage basically recovered to a green phenotype consistent with the wild type.

2、   This experiment cloned a new gene TCD6 encoding PPR protein in rice, and proved that the defect of TCD6 gene was the cause of rice leaves phenotype change.

3、   According to the determination of photosynthetic pigment content and the observation of chloroplast submicroscopic structure, the development of chloroplast in the third leaf of tcd6 mutant was seriously blocked and the photosynthetic pigment could not be synthesized, which eventually led to albino leaf.

4、   The transformation experiments of tobacco protoplasts showed that TCD6 protein was located in chloroplasts, and tissue localization analysis showed that TCD6 gene was an essential gene in the early stage of leaf development in rice seedling stage, and regulated the development of chloroplast in leaves.

5、   TCD6 gene is involved in regulating PEP activity in early rice leaves. The mutation of TCD6 gene will reduce the PEP activity in the early leaves of rice, which will affect the third stage of chloroplast development and eventually lead to early leaf bleaching.

6、   The splicing analysis of chloroplast transcripts in rice showed that TCD6 gene was involved in the splicing of plastid gene ndhA transcripts in early leaf development of rice seedling stage. We found that TCD6 gene is involved in the RNA editing of ndhA gene by sequencing ndhA gene transcripts.

Key Words: Rice; TCD6; Chloroplast; PPR proteins; RNA splicing; RNA editing

目录

摘要............................................................... I

Abstract.........................................................  II

目录............................................................. III

第1 章 绪论........................................................ 1

1.1  研究背景及意义............................................  1

1.2  植物叶绿体发育的相关研究..................................  1

1.3  植物叶色突变体的相关研究..................................  2

1.4  植物 PPR 蛋白的相关研究.................................... 3

1.4.1   PPR 蛋白的结构与分类................................ 4

1.4.2   PPR 蛋白的分子功能.................................. 5

1.4.2.1   PPR 蛋白参与 RNA 的编辑........................  5

1.4.2.2   PPR 蛋白参与 RNA 的剪接........................  6

1.  4. 2. 3 PPR蛋白参与RNA的稳定与加工.................. 7

1.5植物中已克隆的PPR基因...................................... 8

1.6 本研究的目的及意义.......................................... 9

第2章 突变体的表型与生理生化特性分析............................. 10

2.1   实验材料与种植条件........................................ 10

2.2   实验方法.................................................. 10

2.  2. 1   突变体苗期叶色表型观察.......................... 10

2.2.2   光合色素含量的测定.................................. 10

2.2.3   叶绿体亚显微结构观察................................ 11

2.3   结果与分析................................................ 11

2.  3. 1   突变体的表型分析及光合色素含量变化.............. 11

2.  3. 2   突变体叶绿体亚显微结构分析...................... 13

2.4   小结...................................................... 13

第3章突变基因的图位克隆.......................................... 15

3.1   实验材料与种植条件........................................ 15

3.2   实验方法.................................................. 15

3.2.1   遗传分析............................................ 15

3.  2. 2水稻叶片DNA的提取................................. 15

3.2.3   分子标记的筛选与设计................................ 17

3.2.4   目的基因的连锁分析与定位............................ 17

3.2.5   候选基因的获取及目的基因的确定....................  1 8

3.3   结果与分析..............................................  1 9

3.3.1   突变性状的遗传分析.................................. 19

3.3.2   目的基因的定位....................................  1 9

3.3.3   候选基因的确定...................................  2 0

3.4   小结.....................................................  21

第4章TCD6基因的互补验证及功能分析............................... 23

4.1   实验材料.................................................  23

4.2   试验方法.................................................  23

4.  2. 1 RNA提取及cDNA反转................................ 23

4.2.2   载体构建...........................................  24

4.2.3   感受态细胞的制备...................................  27

4.  2. 4 tcd6亲本的组织培养和遗传转化...................... 27

4.2.5   烟草原生质体的提取与转化实验........................ 29

4. 2.6 TCD6基因系统进化树与组织特异性分析................. 30

4.2.7   水稻叶绿体转录本的剪接和编辑分析................... 31

4.2.8   tcd6突变体中TCD6基因及其相关基因的表达分析......... 32

4.3   结果与分析................................................  3 3

4.3.1   转基因互补植株的获得与检测......................... 33

4.3.2   TCD6 蛋白亚细胞定位于叶绿体上...................... 34

4.3.3   TCD6 蛋白的系统进化树分析.......................... 35

4. 3.4 TCD6基因的组织特异性表达........................... 37

4. 3.5 TCD6基因参与叶绿体基因的剪接与编辑................. 39

4. 3. 6 tcd6亲本中PEP、NEP相关基因的表达................. 40

4.4   小结......................................................  41

第5 章 总结与讨论.................................................  4 3

5.  1 TCD6基因是水稻幼苗五叶期前叶片中叶绿体生长发育所必需的... 43

5.  2 TCD6蛋白参与了叶绿体转录本ndhA的剪接和RNA编辑,影响光电子的

传递..........................................................  44

5.3   总结......................................................  46

参考文献..........................................................  48

附录.............................................................. 57

攻读学位期间取得的研究成果........................................ 59

致谢..............................................................  6 0

第 1 章 绪论

1.1  研究背景及意义

水稻(Oryza sativa LJ是重要的粮食作物。水稻基因组计划的成功实施, 大大加快了水稻研究和育种的过程,并且水稻突变体是当前进行水稻功能基因组 研究的重要材料。叶绿体相关基因的突变能够使水稻产生异常的叶色表型,这些 异常的叶色突变体对水稻叶绿体发育及调控过程的研究至关重要,并且这些异常 叶色表型的水稻还可以用于光合作用和植物抗逆机制的研究[1]。在实际的水稻种 植中,水稻的叶色突变体还可以作为叶色的性状标记对水稻的育种提供便利。因 此,研究水稻功能基因的作用以及水稻生长发育的分子机制,对全国粮食生产、 提高稻谷产量具有重大的理论指导和实践意义。

本研究涉及到一个编码PPR蛋白的基因,研究表明,细胞器内RNA的加工过 程普遍与PPR蛋白有关。水稻中标注的PPR蛋白有477个,然而,大多数PPR蛋 白的功能目前尚未明确。因此,克隆与研究新的PPR蛋白基因,是深入探索水稻 叶绿体发育机制的重要途径。

1.2  植物叶绿体发育的相关研究

叶绿体是植物和绿藻的特征细胞器,拥有自己的微小基因组,负责各种基本 功能,这些功能包括光合作用、脂质代谢、淀粉和氨基酸的生物合成等[2]。先前 研究者通过比较基因组学的方法分析发现,大约有 2500到 3000种蛋白质存在于 叶绿体中,并且,到目前为止,总共已经鉴定出了约1750 种不同的叶绿体蛋白[3]。 虽然叶绿体有它们自己的基因组,但叶绿体中绝大多数蛋白质都是由核基因组编 码的,只有少数蛋白质是由其自身的质体基因组编码的[3]。

对植物叶绿体从发育到成熟整个过程的研究表明,叶绿体发育的好坏直接影 响植物的萌发、种子的结实及生长状况。具有光合活性的叶绿体依赖光照,其发 育可分为三个步骤,并且受质体基因组和核基因组的共同调控[4]。第一步,质体 DNA的合成与复制被激活,基因OsPOZPZ (负责编码质体DNA聚合酶)[5]和&sZ (负责编码质体分裂元件)[6]开始表达。第二步,通过核编码的RNA聚合酶(NEP) 转录与质体基因表达机制相关的基因来完成叶绿体的积累和叶绿体遗传系统的 快速建立,在这一过程中质体编码的基因的转录和翻译水平明显上升[4]。叶绿体 遗传系统依赖于基因OsRpoTp (编码NEP)、2 (编码质体鸟苷酸激酶)、rpoA (编码PEP a亚基)以及rpoB (编码PEPB亚基)[7]叫 第三步,建立光合器官 的长期功能,该过程涉及到PEP转录的质体基因。在这一过程中PEP的活性增加, 并保持在较高水平,从而使光合装置中质体编码的部分高表达,与此同时,NEP 的活性降低并且保持在较低的基础水平。

水稻叶片的发育过程是连续的,有研究表明,水稻叶片的发育大体可以分为 7个阶段即P0—P6阶段。其中,在P4期,叶片形态的变化最为明显,气孔等表 皮特异性细胞的分化也在该时期发生呵。先前的研究表明,核编码的RNA聚合酶 (NEP)和质体基因在质体转录和翻译装置中的表达也发生在P4阶段,提示叶绿 体分化的早期过程发生在该时期[7][8]。而在P5期,PEP依赖基因如rbcL、psaA、 psbB等开始表达[10],由此可以看出,NEP活性和PEP活性的表达存在先后顺序[11]o

1.3  植物叶色突变体的相关研究

异常的叶色在高等植物中很常见,其中也包括水稻这一种重要的模式植物 [1]。由于植物叶片这一独特的生理特征,具有异常叶色表型的植物被广泛应用于 基础研究,包括光合作用和植物抗逆机制的研究[12][13]。鉴于水稻叶色突变体的表 型主要是在早期叶片生长阶段检测到的,因此,突变类型通常根据幼苗期的叶片 表型进行分类,这些突变表型包括黄色、黄绿色、绿黄色、白色、浅绿色、条纹 等[14]。并且根据颜色突变的生理机制,突变体可分为四种类型:总叶绿素缺乏、 叶绿素a缺乏、叶绿素b缺乏、以及总叶绿素增加等[15]。叶片的正常绿色表型可 归因于叶绿体中储存的大量叶绿素,叶绿素主要分布于叶绿体类囊体膜及其周 围,由叶绿素a和叶绿素b组成,是吸收光能并将光能转化为稳定化学能的主要 光合色素[1]。叶绿素的生物合成涉及到一个由 15 种以上的酶和 27 个基因组成的 催化酶的复合物泅。如在拟南芥中,ch42突变体不能有效地将Mg2+离子螯合成原 卟啉IX,形成镁-原卟啉IX,随后不能有效合成叶绿素[17]。OsCHLH18基因编码水 稻镁-螯合酶的最大亚基,将该基因敲除对水稻生长来说是致命的。

一般来说,水稻叶色突变体的表型是由与叶绿体发育调节相关的基因突变引 起的,相关基因的突变直接或间接地影响代谢途径,最终导致了不正常的叶片颜 色表型。在这些突变表型中,有的与环境温度没有明显的相关性,而有的叶色突 变表型确与环境温度密切相关,表现出明显的温度敏感性。目前为止,水稻中已 经报道了许多叶色突变体的表型,如编码叶绿素合成酶的%L1基因,该基因影 响叶绿素的积累[19]。在yg〃突变体中,幼苗期的黄叶可随着生长的进展而逐渐 变为绿色,因此在籽粒成熟时的叶片颜色与野生型相似。与野生型相比,ygl1 突变体保持了较高的光合效率和较强的光抑制耐受性。在另一个yl7突变体中, 叶片在整个生长期都保持黄色,但其产量确没有下降,因为该突变体的光电子利 用率和光合速率高于野生型匈。而YGL22⑴蛋白是一种核编码的叶绿体靶向蛋白, 在早期叶色发育中发挥着重要的作用。由于YGL22蛋白功能的丧失,使得水稻在 五叶期前叶片均为黄绿色,并且叶绿体发育出现缺陷,叶绿素合成量降低。本实 验室报道的A5L2基因[21],该基因编码质体核糖体蛋白L21,其突变能导致叶绿 体发育异常以及苗期致死。在asZ2突变体中,叶片颜色的改变与叶绿素(Chi) 含量和叶绿体的发育异常有关。本实验室报道的另一个基因ASL3^,该基因编 码一个具有10个串联PPR基序的PPR蛋白,该基因缺陷会使水稻叶片发育早期 叶绿体发育异常,光合色素合成受阻,最终导致幼苗白化致死。

上述叶色突变体的表型均与环境温度没有明显的关联性,其表型从种子萌发 后就出现,与生长温度无关。而像tcd5 (编码单加氧酶的基因突变)、tcd9沁 (编码Cpn60蛋白的一个亚基的基因突变)、tcdO (编码PPR蛋白的基因突 变)、ted]怦(编码核糖体小亚基蛋白S6的基因突变)等突变体则是低温敏感 型突变体,该类突变体多数情况下在水稻叶片发育早期表现出明显的低温白化表 型,同时伴随着光合色素含量下降及叶绿体发育受阻,温度升高其表型往往恢复。 还有一类突变体是高温敏感型,即常温或低温条件下表现出正常表型而高温条件 下确出现明显的叶色突变性状。如,w4n,w1严」突变体在高温条件下(30°C-35°C) 表现出明显的叶片白化表型;tcm5-^基因编码叶绿体靶向凹点蛋白酶蛋白,其突 变后,te5突变体在高温条件下(32°C)表现出明显的叶片缺色表型,但在低 温(20°C)条件下表现出正常的野生型表型。

1.4植物PPR蛋白的相关研究

虽然在21世纪以前,单个的PPR基因已经在酵母等突变体的研究中被描述, 但是随着拟南芥基因组测序的成功进行,PPR蛋白质大家族的存在才逐渐变得明 显起来[30]。事实上,该家族蛋白虽然有35个氨基酸重复序列类似于TPR基序, 但它们与TPR基序确有着显著的特征性差异,为了区分它们与TPR基序的不同, 研究者们将该类蛋白家族称为PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白匕切。

PPR蛋白的特点是在其氨基末端区域存在一个名为P的基序的重复序列,P 基序是五肽基序,即一种由35个氨基酸组成的退化多肽,与PPR蛋白高度特异[31]。 遗传、分子和生化证据表明,大多数PPR蛋白都具有序列特异性RNA结合活性阳。 PPR蛋白被认为是分子适配器,能够使RNA的加工活动针对特定的RNA分子[33]。 水稻和拟南芥PPR家族惊人地相似,远比其他已经被详细研究的大型基因家族更 多,在这两个物种中有超过80%的家族成员存在明显的同源蛋白[34]。根据一系列 被子植物表达的序列标记(EST)数据显示,PPR基因在包括裸子植物和苔藓植物 在内的所有陆地植物中都有许多[35]。一些PPR蛋白参与了植物的发育,另一些 PPR蛋白是细胞质雄性位的恢复因子,多数PPR蛋白在线粒体和叶绿体中起着至关重要的作用[31]

尽管植物中存在很多个由PPR基因编码的PPR蛋白(图1T),但很少存在 无功能蛋白。并且,对观察到的PPR蛋白在各种转录本的编辑、剪接、稳定性和 翻译方面的功能,目前最简洁的解释是每个PPR蛋白可能直接与目标RNA中的一 个特定位点相互作用[35]。

image.png

图 1-1 真核生物 PPR 基因的分布[35]

黄色线条表示的是 P 亚家族的数量,绿色线条表示的是 PLS 亚家族的数量;每个生物体中PPR 基因的总数在坐标轴右侧标出。

1.4.1   PPR 蛋白的结构与分类

大多数真核生物都含有一个小的多基因家族,该家族编码约5-30个PPR蛋 白,但是在陆地植物谱系中,该家族数量大大扩大氛。植物PPR家族由两个主要 的亚家族组成,分别为P亚家族和PLS亚家族阳。考虑到把典型的PPR基序作为 原型P基序,因此,P类蛋白质仅包含P基序阵列;而PLS类蛋白质,最初被称 为植物组合模化蛋白,其典型特征是含有P、L、S三组基序昭。其中L基序含有 35-36个氨基酸,S基序含有31个氨基酸,每一种氨基酸都有特定的氨基酸保护 模式来区分它们[33][37]。

大多数P类蛋白质由一个或多个PPR束组成,几乎没有其他的序列,该PPR 束是一个N端细胞器的靶向序列昭。而E或DYW的C-末端结构域确总是存在于 PLS蛋白中,这类蛋白质是独一无二的阴。为了对PPR家族中的C端基序进行正 确的定义,Lurin等人比对了目前已知的拟南芥PPR蛋白中最后一个PPR相关基 序的多肽序列C端,最终定义了 3种不同的基序,分别是E、E+和DYW基序,这 三种基序只在由P-L-S重复序列定义的亚家族中被发现阴。尽管这些新的基序与PPR基序并不相关,但这三个基序仅存在于PPR家族成员中,而不存在于任何其 他拟南芥蛋白中,At1 g47580蛋白除外,该蛋白包含一个独立的DYW基序阴。根 据Lurin等人的研究,这三个C端基序的相对排布遵循以下规则:(1)在同一 蛋白质中,从未在多个拷贝中观察到这些基序;(2)当在同一蛋白质中观察到 这类基序时,其顺序为E—E+—DYW,其中DYW为C末端的三肽;(3)携带DYW 基序的蛋白,其前面几乎总有E和E+基序;同样,携带E+基序的蛋白,其前面总 是有E基序阴。因此,Lurin等人将PPR蛋白中的PLS亚家族进一步分为4个亚 群:(1)没有E、E+和DYW这3个C末端基序的蛋白质,(2)只有E基序的蛋 白质,(3)具有E和E+基序的蛋白质,(4)具有E、E+和DYW基序的蛋白质; 这4个亚群分别被命名为PLS、E、E+和DYW亚群阳。

在PLS蛋白中,这些E或DYW结构域与植物细胞器中的RNA编辑有关[39] [40] [41], RNA编辑是一种将特异半胱氨酸嘧啶转化为尿嘧啶的脫胺化反应[42]。DYW结构域 与其他蛋白质中的核苷酸脱氨酶结构域有关,并包含一个与已知的胞苷脱氨酶活 性位点特征相似的保守特征[43]。

image.png

图 1-2 植物 PPR 蛋白示意图[32]

1.4.2  PPR 蛋白的分子功能

PPR家族的一个有趣的特点是它由相对较小的蛋白质结构组成,但表现出不 同的分子功能。对PPR基因的功能分析主要依赖于遗传工具,目前对这个蛋白质 家族的作用研究,所得到的大部分了解都是基于研究PPR基因的单基因突变或更 常见的等位基因的单基因研究旅。遗传数据表明,PPR蛋白参与了细胞器基因表 达的每一步:转录、RNA稳定、RNA切割、RNA剪接、RNA编辑和翻译泅。

1.4.2.1 PPR蛋白参与RNA的编辑

RNA编辑是mRNA上的一种化学修饰,可以使一种mRNA编码两种蛋白或将节 略的RNA转变为有功能的RNA,因此,经过编辑的RNA序列相比于模板DNA序列 往往发生了不同程度的变化。在真核生物、病毒、古细菌以及原核生物的一些 tRNA、rRNA、mRNA或微RNA分子中均观察到RNA的编辑现象盟。RNA编辑发生在 细胞核、胞浆、线粒体和质体内。在植物细胞器中,RNA的编辑形式包括:胞嘧 啶(C)到尿嘧啶(U)、尿嘧啶(U)到胞嘧啶(C)、腺嘌吟(A)到次黄嘌吟 (I)这三种转换[47]。在以上三种编辑形式中,存在最多的是胞嘧啶(C)到尿嘧 啶(U)的变化,这一变化能够使植物中某些突变的保守序列得到恢复,并且在 变化的过程中还可能产生一些新的密码子,为植物中存在缺陷的细胞器转录本提 供了可能的修复机制[47]。

首先被报道的与RNA编辑有关的PPR蛋白是模式植物拟南芥中的CRR4蛋白, 该蛋白能够编辑拟南芥叶绿体力必D基因(编码叶绿体NAD脫氢酶亚基)mRNA的 起始密码子屈。随后,CRR21蛋白也被证明参与拟南芥"必D基因转录本中不同 位点的编辑丽。第三个被报道参与RNA编辑的PPR蛋白是CLB19(CHLOROPLAST BIOGENESIS 19),该蛋白需要编辑质体clP(编码叶绿体蛋白酶亚基)和rpoA (编码叶绿体RNA聚合酶亚基)转录本中的特定位点槪。上述报道的与RNA编辑 有关的三个PPR蛋白都带有E基序的C-末端序列。到目前为止,发现的对RNA 具有编辑作用的PPR蛋白都是PLS型家族成员泅。研究证明,PLS型蛋白的PPR 片段能形成一个结合位点,识别单链RNA分子中的初级序列。

最新报道的OsATP4蛋白是一种PLS型的PPR蛋白,其编辑核糖体蛋白S8转 录本rps8的特定核苷酸[51]o张等人报告的水稻PLS-E亚类PPR蛋白PPR756,参 与atp6、ccmC和*ad7等三个线粒体基因的RNA编辑,并且可以直接与以上3个 靶基因结合,PPR756蛋白还能够与0sM0RF1、0sM0RF8T以及OsMORF8-2蛋白 相互作用(这3个蛋白属于多个细胞器RNA编辑因子)盟。目前为止,34个主 要的编辑位点已经在拟南芥中确定[53],水稻质体中有 21 个编辑位点被确定[54]。

1.4.2.2 PPR 蛋白参与 RNA 的剪接

RNA剪接是指前体信使RNA(pre-mRNA)的内含子被移除,其外显子被连接的 加工事件閃。由朱玉贤等主编的现代分子生物学中,将RNA剪接分为5种可能的 模式(图1-3)。在一些原核生物中,II组内含子可以自我拼接,但植物细胞器 转录物的II组内含子已经失去了这种能力,需要核编码的蛋白质来剪接阴。PPR 蛋白在这些具有RNA剪接功能的蛋白中占据显著地位,参与剪接植物中许多叶绿 体基因组编码的转录本,这些PPR蛋白包括拟南芥中的OTP51[58]、OTP70[57]、AEF1丽 蛋白,玉米中的PPR4[61]、PPR5[60]、THA8[62]蛋白以及水稻中的0sPPR4阴、WSL[64] 蛋白等,这些蛋白质中的每一种都参与一个或两个内含子的剪接。

image.png

OsPPR5蛋白定位于水稻叶绿体上,属于PPR蛋白中的P家族,OsPR5基因 的突变能够导致线粒体NADH脫氢酶4 (nad4基因内含子3的顺式剪接效率降低 并且降低复合物 I 的活性及组装效率,使种子胚乳发育异常[65]。同样是线粒体定 位的P亚家族PPR蛋白OsPPR939是剪接水稻中nad5基因内含子1、2、3所必需 的肮。而吴等人报道的水稻中无胚根1(刃1突变体在幼苗期表现出明显的胚根 缺陷,并在胚乳中破坏了籽粒的填充[67],该基因编码的 RL1 蛋白特异性地参与了 线粒体nad4转录本内含子1的剪接[67]o /LOZ8基因也是编码一个定位于线粒体 的P型PPR蛋白,该蛋白具有15个PPR基序,其功能的丧失能够导致线粒体nad5 转录本的5,端处理存在缺陷阴。上述这些最新报道的PPR蛋白均属于P亚家族, 并且都定位于线粒体上,该类蛋白的缺陷均会影响线粒体的发育以及 ATP 的积 累。

1.4.2.3 PPR蛋白参与RNA的稳定与加工

PPR蛋白除了参与RNA的编辑与剪接,还调控RNA的稳定。一种假设认为, 这些PPR蛋白能够保护核酸酶敏感位点免受其他质体定位的核酸内切酶的影响 庶。与这种保护功能完全相反的是促进核酸内切的PPR蛋白,如质体蛋白CRR2, 该蛋白是加工拟南芥中ndhB-rps7二顺子前体RNA的必需蛋白[69];和质体蛋白 PPR531-11,该蛋白在体内支持CpP和rps12之间的切割[70]o

迄今为止,植物中也报道了几个参与RNA稳定的PPR蛋白,如定位于质体的 ZmPPR10蛋白,该蛋白与atpI-atpH和psaJ-rpl33基因间约18个核苷酸结合[71]。 ZmPPR10与RNA的结合能稳定体内RNA,保护转录本在任何方向都不受核酸外切 酶的影响,并且通过重塑RNA结构来激活mRNA翻译[71]。此外,PPR蛋白也会阻 碍限制性核酸内切酶对RNA的影响。如ZmPPR5对稳定trnG(UCC)前体RNA非常 重要,该前体RNA在ZmPPR5蛋白缺失后会被迅速降解[72]。未来的研究则需要解 决以上这些事件是否存在一个由PPR蛋白介导的因果序列。并且,相互作用的 RNase的鉴定对于了解PPR蛋白对RNA裂解和降解的增强或抑制作用具有重要意

1.5  植物中已克隆的 PPR 基因

PPR蛋白是陆地植物中最大的蛋白质家族之一,其参与了植物生长和发育的 几乎所有方面。PPR突变体在基因筛选的过程中被发现,可以用来寻找各种突变 表型,包括光合作用缺陷、叶绿体发育异常、生长缺陷、种子或胚胎发育异常、 对非生物胁迫反应敏感、对脱落酸过敏、对不同生物合成途径的抑制剂具有耐受 性以及花粉发育受限等测。在水稻中共鉴定出了 491个PPR蛋白,但只有少数几 个蛋白的功能已被报道[74]。

据文献报道,大多数的PPR蛋白在线粒体或叶绿体中定位,少数PPR蛋白在 细胞核中定位沏。植物中已报道的PPR蛋白的功能中,与叶绿体相关的最多,该 类蛋白与叶绿体的发育及光合作用有关,其突变往往会使植物幼苗叶片颜色发生 改变泗。第一个关于水稻中叶绿体生物发生所需的PPR蛋白的报告是0sPPR严 基因,该基因由2433个核苷酸组成,编码810个氨基酸,包括11个PPR基序, 其编码的蛋白质定位在叶绿体上。0sPPR1蛋白[76]的缺陷会导致水稻幼苗严重白 化,最终因为无法进行光合作用而死亡。0sPPR3基因编码的蛋白定位于叶绿体 上,其突变体在叶片发育早期出现明显的白色条纹,四叶期后恢复正常o0sPPR6^ 基因所编码的蛋白参与水稻〃必B基因的编辑和yc/3基因转录本的剪接,该蛋白 功能与叶绿体有关,其突变导致ospw6早期叶片的叶绿体发育缺陷,最终造成 白化病叶和幼苗死亡。

线粒体定位的PPR蛋白往往与细胞呼吸有关,由于线粒体的特殊性,该类蛋 白的突变会导致细胞呼吸链的电子传递受阻,从而影响植物细胞生长的能量供 应,最终导致植物无法正常发育沏。如水稻中的PPSl^基因,该基因编码一个 含有DYW基序的五肽重复蛋白,PPS1蛋白与*ad3的5个保守的RNA编辑位点相 关,这5 个编辑位点位于线粒体中彼此靠近的位置,这5 个位点的编辑都是从脯 氨酸到亮氨酸的转化。pps1突变体在营养期和生殖期都表现为发育迟缓和部分 花粉不育网。水稻中的另一个PPR蛋白FL010跑是一个含有26个PPR基序的P 亚家族的PPR蛋白,该蛋白定位于线粒体上。FL010蛋白的功能丧失将会影响线 粒体nadl内含子1的反式剪接,会导致nadl外显子1和外显子2-5前体的积累 增加,使水稻淀粉胚乳中的淀粉颗粒发育较小,并且出现发育较小的异常细胞[80]。

此外,还存在一类特殊的PPR蛋白,该类蛋白定位在细胞核中,到目前为止 总共报道了 5 个核定位蛋白,其中拟南芥中报道了 3 个,水稻中报道了 2 个。分 别是拟南芥中的GRP23[81]蛋白,该蛋白定位在细胞核上,在拟南芥早期胚胎发育 过程中,作为基因表达的潜在调节因子与RNA聚合酶II亚基III发生物理相互 作用。第二个是拟南芥中的PNM1[82]蛋白,该蛋白双定位于细胞核和线粒体,与参与基因表达调控的核蛋白相互作用。遗传互补表明,线粒体中PNM/基因功能 的丧失,对胚胎来说是致命的阴。第三个是拟南芥中的S0AR1[83]蛋白,该蛋白是 一种胞浆和细胞核的双定位蛋白,是CHLH/ABAR(Mg-螯合酶H亚基/假定的ABA 受体)介导的信号通路中的一个关键的调节剂,能够作用于CHLH/ABAR的下游和 核ABA应答bZIP转录因子ABI5的上游。而在水稻中报道的两个细胞核定位的五 肽重复蛋白分别是0sNPPR1関蛋白和0sNPPR2泗蛋白。其中,0sNPPR 1蛋白是水 稻中第一个文献报道的定位在细胞核上的PPR蛋白,该蛋白参与线粒体的发育及 其功能调节,其功能丧失会导致水稻胚乳中淀粉颗粒排列松散,淀粉含量下降, 最终导致幼苗生长迟缓。水稻中另一个报道的定位于细胞核的 PPR 蛋白是 0sNPPR2蛋白,在该蛋白的突变体Z29中,nadl (编码线粒体复合物I的一个亚 基)的转录出现异常。通过对突变体Z29nad1基因测序比对发现,nad1第一 内含子中的714bp片段没有被切割,最终导致水稻种子线粒体结构异常,呼吸途 径受损,严重延迟水稻的生长[75]

1.6  本研究的目的及意义

本实验研究的是一个定位于叶绿体中的PPR蛋白。研究材料是经EMS化学诱 变剂诱变水稻品种“嘉花1号”得到的苗期叶色白化突变体tcd6,该突变体幼 苗在二叶期、三叶期时表现出明显的叶片颜色缺失表型,四叶期白化逐渐恢复, 五叶期长出的第 5 叶完全恢复成与野生型一致的绿色表型,并且该叶色表型变化 与温度无关。通过图位克隆,克隆到了一个新的与叶绿体发育相关的基因 L0C-0s06g02200,命名为TCD6,该基因编码一个新的水稻PPR蛋白,定位于叶 绿体上。通过亚细胞定位、组织特异性表达、RNA剪接与编辑分析及相关基因表 达量分析等方法对该基因的功能进行解析,丰富了水稻中PPR基因的功能,为叶 绿体发育的内在机制研究提供一定的理论基础。

第2章 突变体的表型与生理生化特性分析

水稻苗期叶色白化突变体tcd6是粳稻品种“嘉花1号”经EMS化学诱变剂 诱变得到的突变体,该突变体在发育的过程中,二叶期和三叶期表现出明显的叶 片缺色表型,四叶期逐步恢复,五叶期叶色表型恢复到与野生型一致。为了更详 细地了解突变体tcd6的表型变化及叶绿体发育情况,我们分别对突变体tcd6和 野生型叶片中的光合色素含量及叶绿体超微结构进行对比分析。

2.1  实验材料与种植条件

突变体tcd6是粳稻品种“嘉花1号”经EMS化学诱变剂诱变得到的,由上 海师范大学遗传研究所提供。用于农艺性状观察的野生型“嘉花1 号”和突变体 tcd6分别种植与上海和海南实验基地,用于苗期表型性状观察的幼苗分别培养 种植在20°C和32°C的人工光照培养箱中(GXZ智能型,宁波江南仪器厂制造), 设置40%的湿度,光照处理12h,光强为180umol • m-2 • s-1。

2.2  实验方法

2.2.1右突变体苗期叶色表型观察

将tcd6突变体亲本和野生型“嘉花1号”种子放在32C光照培养箱中浸种 催芽3 天,观察种子发芽情况。然后将成功发芽的种子播种到不锈钢托盘上,标 好标签;每一盘加入少许清水(稍微浸过种子就好),然后用保鲜膜将其封好。 最后分别将播种后的托盘放在20C和32C的光照培养箱中培养,每天早晚观察 幼苗的生长状况,定期浇水,并记录其表型变化。

2.2.2  光合色素含量的测定

突变体tcd6和野生型叶片的光合色素含量测定参照先前的研究方法阴。光 合色素提取液的制备按照乙醇:丙酮:水=5:4:1的比例进行配置。将32C条件 下突变体tcd6和野生型“嘉花1号”展开的第3叶、第4叶、第5叶中间部分 剪下,分别称取0.02g并用剪刀剪碎放入10ml离心管中,然后加入5ml光合色 素提取液,最后用锡箔纸裹住离心管,室温放置18h—24h,等到叶片中的色素 全部溶解在提取液中后,吸取上清液放到比色皿中(占比色皿总体积的三分之 二),分别在470nm、645nm、663nm紫外波长下记录各样本在该光波下的OD值。 然后用统计好的各波长下的OD值按照公式分别计算出Chia (叶绿素a)、Chib(叶绿素b)以及Car (类胡萝卜素)的含量,实验测量时需要做3次重复,每 次重复的条件必须保持一致。以下是计算过程中所用到的公式:

Chi =6.63E663+1 &08E645

Chia—13.9 5Eg63-6.8 8Ee45

Chlb=24.96E645-7.32E663

Chlc-(1000E47o-2.05Chla-114.8Chlb)/245

单位;浓度mg/L

再通过公式:叶绿素含量(mg/g-FW)=C*VT/FW/1000*n FW:鲜重(g); VT:提取液总体积(ml); n:稀释倍数

2.2.3   叶绿体亚显微结构观察

在观察水稻叶绿体亚显微结构时需要用到 2.5%戊二醛固定液,该固定液可 以提前配置好并放入4°C冰箱保存备用,其配方是:25%戊二醛溶液5ml加入0. 2M PH7.4磷酸缓冲液25ml,然后加水20ml。分别取32C条件下突变体tcd6和野生 型“嘉花 1 号”水稻幼苗展开的第 3叶、第 5 叶中间部分,然后将叶片剪成小方 块,每块边长约为5mm,放到2.0ml的EP管中,然后加入2ml固定液(尽量排 尽气泡,让固定液充满EP管)。将制备好的样本送至上海师范大学分析测试中 心,在中心老师的操作下进行电子透射电镜的观察。观察用到的透射电镜是日本 生产的,型号为 Hitachi765 型。

2.3   结果与分析

2. 3. 1右突变体的表型分析及光合色素含量变化

通过观察发现,水稻tcd6突变体无论是在高温(32C)还是低温(20C) 条件下,其二叶期、三叶期均表现出明显的叶片白化表型,四叶期的第 4叶逐渐 恢复,五叶期的第 5 叶基本恢复至与野生型“嘉花 1 号”一致的绿色表型(图 2-1 A、B)。然后将长到五叶期的幼苗移栽到自然环境条件下生长,直到抽穗期, 突变体cd6的表型与野生型“嘉花1号”基本一致(图2-1 C)。根据以上结 果可以看出,tcd6突变体的突变表型变化与温度变化无关,并且该突变体的表 型在幼苗生长的过程中逐渐恢复,由此可以推测,引起tcd6突变体表型变化的 突变基因只在水稻叶片早期起作用即该突变基因是水稻早期叶片生长发育的必 需基因。

image.png

图2-1水稻突变体(tcd6)与野生型(WT)幼苗分别在高温(32C)和低温(20C)条件下各叶期的叶片颜色表型图。

A:高温(32C)条件下突变体(tcd6)与野生型(WT)的苗期图;B:低温(20C)条件下 突变体(tcd6)与野生型(WT)的苗期图;C:自然条件下,突变体(tcd6)与野生型(WT) 抽穗时的表型图。

然后我们分别对32C条件下突变体tcd6的第3叶、第4叶、第5叶的光合 色素含量进行测定,通过测定结果,我们发现,tcd6突变体白化的第3叶中光 合色素含量几乎为0 (图2-2 A),第4叶中光合色素含量恢复至野生型一半的 水平(图2-2 B),第5叶中光合色素含量与野生型基本一致(图2-2 C)。这 一结果与突变体tcd6的表型变化相吻合,说明该突变基因能够影响水稻早期叶 片中光合色素的合成,从而导致早期叶片白化。 

image.png

图2-2高温(32C)条件下,水稻突变体tcd6和野生型中第3叶、第4叶、第5叶的光合 色素含量比较。

A:突变体tcd6和野生型第3叶中的光合色素含量;B:突变体tcd6和野生型第4叶中的光 合色素含量;C:突变体tcd6和野生型第5叶中的光合色素含量;

2.3.2           突变体叶绿体亚显微结构分析

为了观察、了解tcd6突变体白化叶片中叶绿体是否发育正常,我们分别采 集了 32C条件下突变体tcd6和野生型“嘉花1号”的第3片叶子和第5片叶子, 并利用透射电子显微镜对这些叶片进行了叶绿体形态结构的观察与分析。通过透 射电子显微镜观察,我们发现,突变体tcd6白化的第3叶与野生型的第3叶相 比,叶绿体部位出现了大量的空泡状结构,并且叶绿体内部的基粒片层大量缺失 (图2-3 A、B);而在tcd6突变体正常的第5叶中,叶绿体结构与野生型第5 叶中的叶绿体结构基本一致,并且基粒片层也清晰可见(图 2-3 C、D)。

以上结果说明tcd6突变体第3叶白化的原因是其细胞内部叶绿体发育缺损, 结构紊乱造成的,与其表型结果相一致。

image.png

2.4  小结

水稻叶色突变体是研究水稻功能基因组的良好材料。迄今为止,已经有许多 水稻叶色突变体的材料被报道,如 ygl1[19]、ygl22[1]、tcd5[23]、tcd9[24]、tcd10[25]、 tcm5^等。这些突变体在幼苗期均表现出明显的叶片绿色缺失,且随着幼苗的生 长,叶片颜色逐渐恢复至与野生型一致的正常表型。这些突变材料叶片表型的变 化有的与温度无关,而有的却表现出明显的温度相关性。如yg1突变体,在 任何温度下,其幼苗期均长出明显的黄色叶片,随着幼苗的生长黄色叶片逐渐变 为绿色;再比如在ygl22突变体中,幼苗长到五叶期前叶片均为黄绿色,同时 伴随着叶绿体发育缺陷,叶绿素含量下降,五叶期后恢复,且这一叶片变化与温 度无关。像本实验室报道的ted严、tcd9\ tcd0突变体,其幼苗四叶期前 在低温条件下均出现明显的叶片白化现象,随着温度的升高,白化叶片逐渐转绿。 本研究通过EMS化学诱变剂诱变粳稻品种“嘉花1号”得到了一个特殊的水稻幼 苗叶色突变体tcd6。通过表型观察,tcd6突变体幼苗四叶期前叶片出现明显的 绿色缺失,五叶期后恢复,且该特殊的叶色表型变化与温度无关。进一步的研究 发现,tcd6突变体中,绿色缺失的叶片中叶绿体的生长发育及光合色素的合成 均出现严重受损。本研究得到的tcd6突变体的叶色表型变化与前述突变体叶色 表型类似,前述突变体的叶色表型变化均是由某个基因突变引起的,因此猜测, tcd6突变体的特殊叶色表型变化也可能是由于某个基因突变引起的,并且,在 该突变体中,是什么机制造成了这一特殊的表型变化,即幼苗 1-4叶叶绿体发育 不正常,5 叶及以后恢复,以上这些都需要接下来进一步的研究证明。

第3章突变基因的图位克隆

为了确定控制tcd6突变性状的目的基因,我们将本实验室保存的籼稻品种 “培矮64S”与突变体tcd6亲本进行杂交得到几代种子,然后将几代种子播下 后,代其成熟自交得到F2代种子,我们利用F2代群体进行遗传分析及tcd6突变 体的图位克隆。

3.1   实验材料与种植条件

突变体tcd6是由粳稻品种“嘉花1号”经EMS化学诱变剂诱变得到的,用 其作为父本,母本用的是广亲和两系不育系籼稻品种“培矮64S”,杂交后将收 获的种子种植于海南实验基地,最终获得F2代种子。将“培矮64S/tcd6”的F2 代种子种植在本实验室32°C的智能光照培养箱中,每天光照处理12h,设置40% 的湿度,并且将照射的光强设置为180umol • m-2 • s-1。待苗期长到3叶期时, 取表现出白化突变表型的苗,然后提取DNA,作为图位克隆的样本库。

3.2   实验方法

3.2.1   遗传分析

随机选取F2代种子750颗,放到32C水浴中浸种3天,每天早晚各换水一 次,代种子发芽后,播种在不锈钢托盘上,并置于本实验室32C的恒温培养箱 中,待长至 3 叶期时,统计绿苗数量与白苗数量,根据孟德尔遗传定律确定突变 基因的遗传方式。

3.  2. 2水稻叶片DNA的提取

本实验过程中tcd6亲本、野生型“嘉花1号”以及籼稻“培矮64S”的基 因组DNA全部采用CTAB的方法提取;F2代的突变表型植株采用TPS的方法提取 基因组DNA。具体步骤如下:

I、TPS法提取水稻基因组DNA:

(1)   取3叶期水稻幼苗或截取2cm长水稻叶片放到2ml离心管中;

(2)  向离心管中加入将叶片打碎的小钢珠,然后加入600吐的TPS提取液;TPS 提取液实验前已经配置好,其有效成分为100mMpH=8. 0的Tris-HCl、10mM pH=8. 0 的 EDTA 和 1M 的 KCl 溶液;

(3)   将离心管置于细胞破碎仪进行破碎,时间为 5min;

(4) 取下离心管并将其置于75C烘箱中,时间为30min,期间每隔15min摇晃 一次;

(5)   从烘箱中取出离心管冷却至室温,然后12000rpm离心5min;

(6) 离心后用移液枪取400吐上清液放入新的1. 5ml离心管中,并加入400微 升的异丙醇溶液,上下摇晃,在实验室室温下放置10min;

(7)   静置后放入离心机中,12000rpm离心5min;

(8) 离心后将上清液倒掉,然后加入400吐的70%乙醇溶液,轻弹管底,使沉 淀上浮;

(9)   12000rpm 离心 5min;

(10) 重复步骤8、步骤9各一次,弃上清,将离心管开盖置于45C烘箱中干燥 沉淀,时间约为 40min;

(11)   往离心管中加入120吐灭过菌的ddH2O溶解DNA沉淀。

II、CTAB法提取水稻基因组DNA:

(1) 将水稻叶片或幼苗用液氮速冻并充分研磨,之后转移至 2ml 离心管中,研 磨的量控制在离心管0. 5ml 刻度线处;

(2) 向离心管中加入65C烘箱预热好的CTAB溶液750yL,上下颠倒,涡旋器 上涡旋1min, 65C水浴锅保温60min,水浴期间每15min振荡一次;

(3) 65C水浴结束后,从水浴锅中把离心管取出,放在室温下冷却;冷却后向 离心管中加入750yL的氯仿-异戊醇溶液,上下颠倒混匀,放入离心机中, 9000rpm,离心10min;其中氯仿-异戊醇溶液是按照24:1的比例配置的;

(4) 离心后用移液枪吸800吐上清液放入新的1.5ml的离心管中,然后加入 500yL的异丙醇溶液,上下颠倒离心管,然后室温下静置10min,将静置好的离 心管放入离心机,12000rpm,离心10min;

(5) 离心后倒掉上清液,然后加入500吐的70%酒精溶液,轻弹管底,使沉淀 上浮,然后12000rpm,离心3min;

(6)   倒掉上清液,重复步骤 5 一次;

(7) 将上清液倒掉,离心管口敞开,放入37C烘箱中烘干,约3h,期间观察酒 精的残留量,待酒精全部挥发干后,加入200吐灭过菌的ddH2O,涡旋振荡,-20C 冰箱保存备用。

注:CTAB溶液的配方:

(1) 用称量天平分别称取CTAB固体4g, NaCl固体16.364g放入500ml烧杯中; 然后加入20ml pH=8. 0的1M Tris-HCl溶液和8ml 0. 5M的EDTA溶液;

(2)   加入70ml灭过菌的ddH2O溶解,然后定容至200ml,用高压灭菌锅灭菌;

(3)    从高压灭菌锅取出并放在室温冷却,然后将400yL0.2%-1%的2-巯基乙醇 溶液加入其中,再加入氯仿96ml和异丙醇4ml,摇晃混匀,4C冰箱保存备用。

3.2.3 分子标记的筛选与设计

运用本实验室现有的统计表中的分子标记对tcd6突变体亲本和“培矮64S” 进行检测,前期总共筛选出了 80对多态性良好的分子标记,并且这80对分子标 记均匀的分布在水稻12条染色体上。用这筛选出的80对分子标记进行初步定位, 确定突变基因所在的染色体后再进行精细定位。精细定位所用到的分子标记是根 据 NCBI 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7term)上公布的粳稻品种"日 本晴”和籼稻品种“9311”的基因组序列的差异,自行设计的分子标记;设计过 程中所用到的引物设计软件为primer premier5.0。实验用到的分子标记见下表所 示:

表3-1突变体tcd6图位克隆所用到的分子标记序列

序号

分子标记名称

正向序列(5,-3,)

反向序列(5,-3,)

1

ID06M00670

TGCTCCGTTTGATTTAGATT

AGTAAATTAAATGCGCCATC

2

ID06M00613

TGCATGGTTTTCTTAATCTT

AAATTTCGGTTATTTCGGAC

3

ID06M01656

CATTAACATCAGGGACCATT

TGATGAAACTGCAGCTATTG

4

ID06M01902

AAAACAAAGGAGTGAGCGT

CACTAAGCTCTACCATGCCT

5

Chr06MM0130

CATCGATTAGCTTACATGGCAACG

ACTAGTGCGACCGTCTTCAATGG

6

Chr06MM0917

CTCCAAATCATCATCTCGGTCAAC

CAGGAAGAGGTCTGCTGCCATCG

7

RM19274

CCTGTGAATGACAACCCATGC

GTATGAGCCAGATTAGCGGTTGC

8

P1

GTAAACCCTATCCCTATGAGTATC

TTCCTTCCTGGTACAGCTCTTC

9

P2

TAGGGAATCAGCGGTTAG

GCAGTGTGGTGTGTGGCA

 

表 3-2 CAPS1 分子标记

分子标记

引物序列

内切酶

引物位置

CAPS1

5,-TGGTGATTAGGTCAAGAAGCATACG-3,

5,-AATTAACCGAGTTGACCATCACACC-3,

Fnu4HI

AP001389

3.2.4

目的基因的连锁分析与定位



 

首先,从生长在32C条件下的F2代群体中随机挑取22株与突变亲本表型一 致的幼苗(白化苗),然后利用筛选出的多态性良好的 80 个分子标记检测这22 株幼苗,通过琼脂糖凝胶电泳条带找出与tcd6亲本普遍连锁的分子标记,并根 据分子标记的物理距离确定该分子标记所在的水稻染色体位置。然后将F?代的突 变植株扩大到679 株,利用新设计的分子标记,对这679 株白化苗进行检测,通 过寻找与tcd6突变体电泳条带一致的分子标记,进一步缩小突变基因的遗传距 离,从而完成精细定位。

定位期间所用到的PCR反应体系及反应流程如下:

PCR 反应体系(

(20 吐)


PCR 反应流程



ddH2O

12. 8吐

预热

94°C

5min


Mg2+ Buffer

2. 5yL

变性

94°C

30sec


dNTP

0. 5yL

退火

50/55/60C

30sec

35 个循环

引物

2yL

延伸

72C

30sec


Tag 酶

0. 2吐

总延伸

72C

10min


DNA 模板

2吐

保持

4C



 

PCR 反应产物用诺唯赞公司提供的 10x DNA Loading buffer 进行核酸染色, 染色后取7卩lPCR产物加到3%-4%浓度的琼脂糖凝胶的点样孔中(琼脂糖凝胶在 配置的过程中已经加入了溴化乙锭),在130V, 400mA条件下进行电泳30min; 电泳结束后取出琼脂糖凝胶,放入上海天能公司生产的紫外凝胶成像仪中,进行 拍照记录。其中PCR所用到的各引物序列均由生物工程(上海)股份有限公司合 成。

3.2.5 候选基因的获取及目的基因的确定

通过自行设计的分子标记,确定tcd6突变体中的突变基因在染色体所处的 范围,用物理距离表示。待物理距离缩小至一定范围且根据水稻基因组注释数据 库(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)确定该范围所包含的候 选基因个数小于 20个时就可以对候选基因进行一代测序。一代测序所用到的引 物序列是根据 NCBI 网站上公布的各候选基因的全基因组序列用 primer premier5. 0软件设计的。PCR扩增tcd6亲本和野生型“嘉花1号”的DNA模板, 扩增产物经胶回纯化后送上海华大基因科技有限公司进行一代测序。测序结果用 BioXM2.6 软件 进行 比对。 PCR 反应体系采用 南京诺唯赞公 司 提供的 P505-d1/d2/d3系列的高保真酶进行扩增;胶回纯化采用康为世纪的胶回纯化试 剂盒,步骤参照操作说明书。

PCR反应体系(50吐):

ddH2O                       up to 50yL

2x Phanta Max Buffer

dNTP

Mix(10mM each)


1yL

上游引物(10yM)


2yL


下游引物(10yM)


2yL

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase

1yL


模板 DNA


3吐

PCR 反应程序:




循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95C

3min


变性

95C

15sec


退火

60C

15sec

32

延伸

72C

30-60sec/kb


彻底延伸

72C

5min


 

3.3   结果与分析

3.3.1   突变性状的遗传分析

为了了解突变体tcd6的遗传特性,将突变体tcd6用作父本,母本用的是籼 稻品种“培矮64S”,杂交后获得几代,然后将收获的种子种植于海南实验基地 让其自交,最终获得F2代种子。其中几代植株表现出正常的绿色表型,F2代种子 播下后,长出的植株出现了性状分离。

我们总共统计了 717株F2代幼苗,其中正常绿色幼苗525株,叶片白化幼苗 192 株,经卡方检验发现,其表型分离比符合孟德尔分离定律3:1 (表 3-3)。 以上数据表明tcd6突变体的白化表型是由核基因控制的单基因隐性遗传。

表3-3 tcd6突变体遗传分析统计表

杂交组合

F2 代群体数(单位:

株)

2

X (3:1)

P

总株数      绿苗株数

白化苗株数

培矮   64S/tcd6

717          525

192

1.21<3.84

>0.05

X2(0.05,d=3. 84

 

f (实计频数-预计频数)2       (。厂Ei )2

X2=右       预计频数               —E—

3.3.2   目的基因的定位

将F2代具有突变表型的幼苗(白化苗)作为定位群体进行图位克隆。首先随机挑选22株具有突变表型的F?代幼苗,利用前期鉴定的80个多态性良好的分子 标记检测,把tcd6突变体的突变基因定位在水稻6号染色体上。

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图3-1分子标记ID06M00613检测的22株F?代突变株的电泳图(tcd6为突变体亲本的电泳 条带,PA是“培矮64S”亲本的电泳条带;9号、16号为交换单株)

然后扩大定位群体到92 株白化表型的苗,利用水稻 6 号染色体短臂上多态 性良好的分子标记,将tcd6突变体的突变基因初步定位在P1和ID06M00613两 分子标记之间,物理距离为1533kb。接着继续扩大定位群体进行精细定位,最 终将定位群体扩大至679株白化苗,利用新开发的分子标记,将tcd6突变体的 突变基因精确的定位到水稻6号染色体短臂P1和CAPS1两分子标记之间,物理 距离为129kb,其间跨越AP001552、AP001389两个BACs号,此区间共包含18 个候选基因(图 3-2)。

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3.3.3   候选基因的确定

经过图位克隆,我们将突变体tcd6的突变基因定位在水稻6号染色体P1和 CAPS1两分子标记之间,该区间的物理距离为129kb,其中包含了 18个候选基因, 根据水稻基因组注释网站的信息,分别对这18 个候选基因进行一代测序,然后 与野生型“嘉花1 号”的基因序列进行比对。通过结果比对我们发现,这18个 候选基因中只有基因L0C_0s06g02200的外显子925bp处有一个碱基“A”(腺嘌 吟脫氧核糖核甘酸)到“T”(胸腺嘧啶脫氧核糖核甘酸)的突变,这一突变让 该处的密码子由AAA (赖氨酸)变成了 UAA (终止密码子),使蛋白质翻译提前 终止(图3-3)。由水稻基因组注释数据库知,L0C_0s06g02200基因编码的蛋白 属于DYW型的PPR蛋白,包含14个PPR基序。到目前为止,水稻中已报道的PPR 蛋白多数都能够影响叶绿体发育,因此,我们可以初步确定L0C_0s06g02200基 因就是最终的突变基因,命名为 TCD6。

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3.4  小结

通过本章的研究,克隆到了引起tcd6突变体特殊叶色表型变化的目标基因 TCD6 (L0C_0s06g02200),该基因是水稻6号染色体上的基因,其编码一个包含 14个PPR基序的DYW型PPR蛋白。PPR蛋白是植物中一类重要的蛋白质家族,如 前面第一章绪论所述,该类蛋白参与了植物质体基因组的调控与加工的过程oPPR 蛋白功能的缺失,往往会导致植物的生长发育受损,如叶片绿色缺失、植株产量 下降、胚胎不育、严重的还会导致幼苗致死等。如水稻中的0sPPR3帀蛋白,该 蛋白的功能缺失使得其突变体叶片在四叶期前出现明显的白色条纹,四叶期后恢 复正常。再如0sPPR6泗蛋白,该蛋白的功能缺失,导致其突变体早期叶片的叶 绿体发育缺陷,最终造成白化病叶和幼苗死亡。在第二章我们已经观察到 tcd6 突变体的叶色表型在四叶期前出现明显的白化,五叶期及以后恢复正常,由此可 以基本确定,本章克隆到的编码PPR蛋白的C6基因就是引起叶片表型变化的 目标基因。并且,上述提到的两个水稻中的PPR蛋白,其突变体的叶片表型性状 均符合经典的孟德尔遗传定律,经分析,本实验研究的tcd6突变体F?代的突变 性状也符合孟德尔分离定律。综上所述,编码PPR蛋白的C6基因就是本实验 需要的目标基因,对于该目标基因的最终确定以及C6基因在水稻叶片生长发 育过程中扮演了一个什么样的角色,还有待接下来更加深入的研究。

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