天天硕士研究生论文网

硕士论文写作范文

圈养赤斑羚内分泌生殖激素检测及发情周期判定

作者:admin1 日期:2022-01-22 17:04:15 点击:147

摘要:赤斑羚N.baileyi又名红斑羚,属于偶蹄目(Artiodactyla)牛科(Bovidae) 羊亚科(Caprinae)斑羚属Naemorhedus),国家一级保护动物,被IUCN评定 为易危级别,被 CITES 收录于附录1

野生赤斑羚分布区域狭窄,种群数量稀少,而圈养赤斑羚目前只存在于上海 动物园,对赤斑羚开展系统性研究的难度极大。上海动物园圈养赤斑羚个体数量 12 只,且适宜繁育个体数量仅为3 只(2 雄1 雌),还存在种群内性别比例严重 失衡的问题,近年来已出现个体数量下降趋势。为了提高赤斑羚繁育率,扩大种 群内个体数量,需要采取科学的辅助措施提高配对成功率。以往通过人工观察赤 斑羚发情行为进行合笼配对的方式较为主观,不仅打乱了原本赤斑羚应有的发情 期节律,极端情况下还可能导致不必要的打斗伤亡。粪便中生殖激素的含量测定 能较为客观地反映个体的发情状态,是一种理想的发情期预测方式。因此,我们 希望建立一种连续采样,有效保存并测定粪便样本中生殖激素含量的方式,结合 传统的人工观察,客观准确地预测其发情期,保证合笼有效性,减轻圈养赤斑羚 心理和生理的伤害。在某些野外条件或者圈养条件下,会出现无法及时处理样本 的情况,寻找一种良好的保存方式是进行粪便激素研究的先决条件之一。对于多 种动物粪便样本的研究表明,不同保存时间和保存方式会导致其粪便激素水平呈 现很大差异。因此,针对赤斑羚进行粪便内激素水平时效性研究就显得至关重要。

本实验试图评估不同贮存方法对粪便激素时效性的影响,五种贮存方法分别 为:( 1)不进行任何处理、( 2) 95%无水乙醇、( 3)乳酸左氧氟沙星抗生素、450°C烘箱干燥、(5-20°C冰柜冷冻,除冷冻处理外其余各组均为室温条 件。同时,我们采用四个时间梯度(15d30d90d150d)检验粪便中雌二醇、 孕酮、睾酮的含量随着贮存时间延长而发生的变化。结果表明,不同激素的最佳 保存方法并不相同。雌二醇可以采用除抗生素外的其余四种方式,其中乙醇为短 效储存(<30d),最优选择为干燥或冷冻;孕酮可以采用除抗生素外的其余四种 方式,最优选择为冷冻;睾酮可以采用除抗生素外的其余四种方式,其中冷冻为 短效储存(<30d),最优选择为不处理。在实际处理时可依据实验条件及仪器灵 活对待。

对于赤斑羚发情期的预测,本研究收集了上海动物园两只育龄赤斑羚(1 雌 1 雄) 2018和 2019年的部分粪便样本,对雌性赤斑羚粪便进行雌二醇和孕酮两 种生殖激素含量测定,对雄性赤斑羚粪便进行生殖激素睾酮的含量测定,绘制曲 线图观察其生殖激素年度波动状况,合理推测发情期从而辅助判断合笼时机。根 据雌二醇浓度年波动状况合理预测雌性赤斑羚发情期在 1 月中后期、 11 月末至 12 月中旬两个时间段。根据孕酮浓度年波动状况合理预测雌性赤斑羚发情期在1 月初期、1月末期、11月初至 12月中旬三个时间段。综合判断雌性赤斑羚预测 发情期为 1月末及 12月中旬这两个时间段。根据睾酮浓度年波动状况合理预测 雄性赤斑羚发情期在 1月初至 3月初且 1月中旬前期更强烈、4 月中至5 月中、10 月中至11月中后期三个时间段。理想条件下,1 月末、11月末这两个时期同 时是雌雄赤斑羚的发情期,理论上在此时期进行合笼成功率最高。由于现实条件 下存在大量不确定性,在实际生产生活中,可采取扩大合笼时间与观察发情行为 两者结合的方式能最大程度上在既保证赤斑羚安全的前提下尽可能提高繁育率。

关键词:赤斑羚;粪便样本;生殖激素;保存时效;发情期预测

Abstract

N.baileyi, also known as the red goral, belongs to the Artiodactyla Bovidae Caprinae Naemorhedus.Protection of animals at the national level. It is classified as vulnerable by IUCNand belongs to CITESAppendix 1 species.

The wild N.baileyi is distributed in a narrow area and the population is sparse. However, the captive N.baileyi currently only exists in the Shanghai Zoo. It is extremely difficult to carry out systematic research on the N.baileyi. There are 12 N.baileyi individuals in Shanghai Zoo, but the number of suitable breeding individuals is only 3 (2 males and 1 female). There is still a serious imbalance in the sex ratio within the structure , and the number of individuals has been declining in recent years . in order to increase the breeding rate of N.baileyi and expand the number of individuals in the more this is necessary to adopt scientific auxiliary measures to increase the matching rate In the past, observing the estrus behavior of the N.baileyi was more subjective, which not only disrupted the original estrus period of the N.baileyi, but may also cause unnecessary fighting casualties in extreme cases. The determination of the content of reproductive hormones in feces can more objectively reflect the individual's estrus state, which is an ideal way to predict the estrus period. Therefore, we hope to establish a continuous collection of rubella faeces, effective storage and determination of reproductive hormone content in fecal samples, combined with traditional manual observations, objectively and accurately predict the estrus period, ensure the effectiveness of the cage, and reduce the captive N.baileyi. Psychological and physical damage.Under certain field conditions or captive conditions, it may not be possible to process samples in time. Finding a good preservation method is one of the prerequisites for fecal hormone research. Studies on a variety of animal fecal samples have shown that different storage times and storage methods can lead to large differences in fecal hormone levels.

Therefore, it is very important to study the time-effect of hormone levels in the stool for the N.baileyi. This experiment verifies the effect of different storage methods on the timeliness of fecal hormones. Collect samples of rubella feces and perform five treatments: (1) No treatment, (2) 95% absolute ethanol, (3) Levofloxacin lactate antibiotic, (4) 50°C oven drying, (5) -20°C Freezer freezing, all groups are at room temperature except for freezing treatment. And from 4 time gradients (15d, 30d, 90d, 150d) to test the changes of estradiol, progesterone, and testosterone in the stool of each gradient. The results show that different hormones require different storage methods. Estradiol can be stored in four ways except antibiotics. Among them, ethanol is short-acting storage (<30d), and the best choice is drying or freezing. Progesterone can be used in four other ways except antibiotics, and the best choice is freezing. Testosterone can use the other four methods except antibiotics, among which freezing is short-acting storage (<30d), and the best choice is no treatment. In actual processing, it can be treated flexibly according to experimental conditions and instruments.

For the prediction of the estrus period of the N.baileyi, this study collected the fecal samples of two reproductive-age N.baileyi (1 female and 1 male) in Shanghai Zoo in 2018 and 2019. The feces of the female N.baileyi were tested for the content of estradiol and progesterone. Determination of male N.baileyi feces to determine the content of the reproductive hormone testosterone, draw a graph to observe the annual fluctuations of the reproductive hormone, and reasonably estimate the estrus period to assist in judging the timing of cage closure. According to the annual fluctuation of estradiol concentration, it is reasonable to predict the estrus period of female N.baileyi in the middle and late January, late November to mid-December. According to the annual fluctuation of progesterone concentration, the estrus period of female N.baileyi is reasonably predicted to be in early January, late January, early November to mid-December. According to comprehensive judgment, the predicted estrus period of female N.baileyi is the end of January and mid-December. According to the annual fluctuation of testosterone concentration, it is reasonable to predict that the estrus period of male N.baileyi will be from early January to early March, with more intense mid-to-early January, mid-April to mid-May, and mid-October to mid-late November. Under ideal conditions, the two periods of end of January and end of November are both the estrus period of male and female N.baileyi. Theoretically, the successful rate of co-cage is the highest during this period. Due to the large amount of uncertainty in actual conditions, in actual production and life, the combination of expanding the cage time and observing estrus behavior can be used to maximize the breeding rate while ensuring the safety of N.baileyi.

Key words: N.baileyi; stool sample; reproductive hormones; preservation time; estrus prediction 

目录

摘要...................................................................... I

Abstract.........................................................................................................................  III

1      绪论....................................................................  1

1.1      赤斑羚种群概况...................................................... 1

1.1.1       野生赤斑羚分布概况............................................. 2

1.1.2       圈养赤斑羚种群概况............................................. 3

1.1.3       赤斑羚昼间活动节律............................................. 4

1.1.4       圈养赤斑羚发情行为............................................. 7

1.1.5       赤斑羚繁殖生态................................................ 9

1.1.6       上海动物园圈养种群变动原因分析................................  11

1.2      ELISA 激素测定研究简介............................................  12

1.2.1       三种待测生殖激素简介.......................................... 12

1.2.2       生殖激素与发情期关联.......................................... 14

1.2.3      ELISA 激素测定的原理与方法...................................  14

1.2.4粪便中激素进行ELISA测定的可行性与准确性分析..................... 16

1.3      研究目的.......................................................... 18

1.3.1     赤斑羚粪便样本保存时效性......................................  18

1.3.2      赤斑羚发情周期判定............................................ 19

2      赤斑羚粪便样本保存时效性................................................. 21

2.1     材料与方法......................................................... 21

2.1.1      实验材料..................................................... 21

2.1.2      实验设计..................................................... 21

2.1.3      激素提取..................................................... 22

2.1.4      激素测定..................................................... 23

2.2      结果与分析......................................................... 24

2.1.1      方差分析..................................................... 24

2.2.2      样本中雌二醇含量变化情况.....................................  24

2.2.3      样本中孕酮含量变化情况........................................ 25

2.2.4      样本中睾酮含量变化情况........................................ 26

2.3      讨论.............................................................. 27

2.3.1      粪便保存方式选择.............................................. 27

2.3.2      误差分析..................................................... 27

2.3.3      生殖激素波动原因.............................................. 28

3      赤斑羚发情周期判定...................................................... 30

3.1     材料与方法......................................................... 30

3.1.1      实验材料..................................................... 30

3.1.2      实验方法..................................................... 30

3.1.2      激素提取与测定............................................... 30

3.2      结果与分析......................................................... 30

3.2.1      依据雌二醇判定的发情周期.....................................  30

3.2.2      依据孕酮判断的发情周期.......................................  31

3.2.3      依据睾酮判定的发情周期.......................................  32

3.3      讨论.............................................................. 33

4      结论与展望.............................................................  35

4.1      结论.............................................................  35

4.2      展望.............................................................  35

参考文献................................................................... 37

攻读学位期间的论文著作...................................................... 42

致谢...................................................................... 43 

1     绪论

1.1     赤斑羚种群概况

赤斑羚(N. baileyi)又名红斑羚,属于偶蹄目(Artiodactyla)牛科(Bovidae) 羊亚科(Caprinae)斑羚属(Naemorhedus),是国家一级保护动物,被IUCN评 定为易危级别,隶属于 CITES 附录1 物种(董元火等, 2008)。

赤斑羚在斑羚属内的分类存在一些分歧,并由此产生了两个版本的分类形 式,在中国使用拉丁文名 Naemorhaedus cranbrooki 较多( Jenkins et al., 2009)。 而关于斑羚属的拉丁文 Naemorhaedus 也曾出现过不同的拉丁文形式,有些作者 会将其拼写成 Naemorheduso( Higham et al., 2011)。但 Grubb 在文章中曾否定 过 Naemorheduso 这 一 说 法 ( Voss & Grubb, 2000 ) 。 因 此 现 今 通 常 采 用 Naemorhaedus cranbrooki 这一拼写形式。

有些学者认为赤斑羚与北斑羚( N. caudatus) 、喜马拉雅斑羚( N. goral) 属于同一物种(Heal et al., 1979)。但目前来说大部分学者还是认为赤斑羚可作 为一个独立的物种。如果仅从地理位置区分,赤斑羚可以与北斑羚和喜马拉雅斑 羚这两个斑羚亚种明显区分开来。北斑羚在中国东部活动,喜马拉雅斑羚在喜马 拉雅山脉附近活动。

部分学者认为赤斑羚应区分成两个亚种:一种是生活在中国西藏地区的西藏 赤斑羚(N. baileyi),第二种是生活在印度阿萨姆与缅甸交界处的缅甸赤斑羚(N. cranbrooki) ,并在之后一段时间里被认为是两个不相关的物种。但 Wilson 和 Reeder提出一个观点,称缅甸赤斑羚和西藏赤斑羚应属于同一物种(Wilson et al., 1993),在那之后有些文献开始记载这两个亚种为独立物种,也有记载为同一物 种的,因此产生许多混淆的说法。

对于赤斑羚标本形态相关研究较少,一般认为缅甸赤斑羚标本的颈部呈现深 红色,西藏赤斑羚标本颈部呈棕色。如果根据颈部颜色的不同作为分类依据,许 多国内关于赤斑羚的文章大多应使用缅甸赤斑羚的拉丁文名。若仅依据地理位置 对这两个亚种进行区分,国内大多数作者使用的缅甸赤斑羚(N.这 一拉丁名应是西藏赤斑羚(N. baileyi) (Rui et al., 1994)。虽然赤斑羚在分类上 至今还没有完全的定论。但是 Hayman 在对缅甸赤斑羚的描述中认为缅甸赤斑羚 和西藏赤斑羚可能属于同一个物种(Hayman, 2010)。至于缅甸赤斑羚标本的颈 部呈现深红色而西藏赤斑羚标本颈部呈棕色的原因,他解释为可能因为缅甸赤斑 羚标本收集于冬季,西藏赤斑羚标本收集于夏季,是季节不同从而导致的赤斑羚 颈部皮毛颜色略有变化。

赤斑羚长度大约为95-105cm,肩高60-70cm,体重40克左右,是典型的斑 羚属体型。头颈部为红棕色,嘴唇呈灰白色。雌雄赤斑羚均生有黑色的双角,较 短且不尖锐,生长方向为后上方,沿着基部的方向有一个棱状的突起,两个黑色 的双角中长有一较小的白点。四肢上半部为灰白色,下半部为棕红色,蹄子较为 粗壮且较其它有蹄类相比更大、更适合攀爬,因而善于在悬崖上奔跑与跳跃。雌 雄赤斑羚均为躯干为黄褐色,脊椎处呈现深褐色条纹,鼠鼷部呈现棕白色(Zheng, 2011),皮毛柔软顺滑。尾巴较短,基本小于10厘米,呈棕黑色(Yan,2006)。

赤斑羚是典型的林栖动物,主要生活地区的海拔高度变化不明显。主要生境 为海拔较高的树林(王英树等, 2014)。活动范围较小,尤其喜欢在地势险峻的 峡谷及深山中活动。赤斑羚最典型的迁徙模式是季节性的垂直迁移(周建华, 2014)。夏季一般生活于树林中较平坦地带。冬季因降雪覆盖,赤斑羚不得不向 下迁徙,转移至降雪线以下地带。活动时间在下午之前,大多成群结队,极少单 独出行,主要活动是觅食和饮水( Rui et al., 2015)。属植食性动物,以草本植 物为食,多为树叶,尤爱嫩芽(殷亚杰, 2016)。中午大部分时间会寻找一块比 较不起眼的石板进行休息。赤斑羚十分机敏,活动之前必定先行巡视,以确保在 活动之前没有危险。如果感知到了危险,便会寻找最近的隐蔽处进行躲藏,很少 进行长距离的奔跑逃生(Min, 2013)。

赤斑羚活动轨迹每天基本固定,不常发生变动,这一特殊的习惯容易导致被 猎人捕捉到活动信息(刘瑞清, 1994)。近年来赤斑羚被捕杀的情况常有发生, 野生赤斑羚生存条件已岌岌可危,对野生赤斑羚的保护刻不容缓。

1.1.1    野生赤斑羚分布概况

1961 年,世界上第一只野生赤斑羚在甸伊洛瓦底江上游的阿屯河岸被发现 (熊振寰,2013)。中国第一只野生赤斑羚最早于1973 年在西藏发现,后续观测 到其活动范围分布在喜马拉雅山脉东端的米林、墨脱、林芝、波米、扎尤五个地 区(刘瑞清等, 1989)。随着近年来猎杀现象频繁,如今赤斑羚在中国的分布区 域被压缩到极小范围,基本活动在帕隆藏布江与雅鲁藏布江的大拐弯相汇合处的 波密(通麦)、林芝(东久、帕隆、八玉)、墨脱一带的峡谷、深山地区,这一 主要分布区域从东到西不到1 10公里,从北到南不到150公里。目前西藏存活赤 斑羚估计已少于1500只(孙晓,2004)。

目前在西藏地区已成立四个自然保护区,其中一个主要保护对象为赤斑羚,分别是位于西藏东南部墨脱县境内的墨脱自然保护区、位于青藏高原的东南边缘 的察隅自然保护区、位于扎木县城以西的波密岗乡自然保护区和位于雅鲁藏布江 大拐弯处的林芝东久赤斑羚自治区级自然保护区(吴鹏举等,2007)。

即使已经出台相关法律法规,野生动物及其制品高昂的价格依旧会驱使部分 人冒着高风险进行非法捕猎,导致野生动物种群数量及多样性急速下降。为此对 圈养种群实行人工繁育迫在眉睫,不仅可以增加个体数量从而扩大种群规模,并 且通过圈养动物的繁育工作可以了解其繁育规律,为推测野生动物的繁育规律提 供参考建议。同时,将圈养动物有规律、有计划地放归野外有助于野生动物种群 扩大(Fakhretal., 2008)。

1.1.2     圈养赤斑羚种群概况

目前仅有上海动物园人工圈养赤斑羚。该种群起始于 1981 年从西藏林芝县 捕获7只(3雄4雌)进行驯养并开始繁殖,其中2只送往广州动物园进行饲养 (Yuan et al., 2019) 。截止至2018年4月30日,上海动物园圈养赤斑羚种群中 个体数量一共为12只,其中包括雄兽9只,雌兽3只。

1981 年至 2018 年上海动物园圈养赤斑羚种群中个体数量变化情况如下(图1)。

总数量■雄性个体数量雌性个体数量未知个体数量

image.png

图1 1981-2018年上海动物园赤斑羚圈养种群数量变化

Fig.l Changes of captive population of Naemorhedus cranbrooki in Shanghai Zoo from 1981 to 2018 

1981 年至2007年种群中个体数量逐年增加,平均增长率为1.064。 2007年 至2018年种群个体数量总体呈下降趋势。 2010-2012年种群数量呈增长趋势(平 均增长率为1.064),但2013-2018,种群数量转为下降趋势(平均增长率为0.868)。 目前存活赤斑羚仅余12只,包括雄性9只,雌性3 只,性比为3:1,已经严重 失衡;仅余的 3 只雌性年龄结构分布各个阶段, 1 只雌性已达 11 岁, 1 只处于亚 成体阶段,都无法参与繁育工作,处于繁殖高峰期的仅 1 只。种群呈严重衰退状 态。

上海动物园圈养赤斑羚种群的基因多样性不高,初代种群基因主要来源于 1981 年野外捕获的五只奠基者,截止目前这五只已全部死亡,没有潜在奠基者。 现有种群只保留了初代奠基者 70.58%的基因多样性。该种群的奠基者基因等量 值是1.70(周军英,2013)。且奠基者的遗传贡献值极其不均衡,其中基因库43.46% 的基因来自于1 只个体, 56.54%的基因来自于另4只个体。种群的平均亲缘关系 值(MK)是 0.2942,平均近亲繁殖系数为 0.2199 (Berrey& Palumbo, 2021)。

目前上海动物园对赤斑羚种群的繁殖体系仅建立于简单的谱系构成,对于种 群的基因多样性、遗传进化潜力尚不了解,近亲繁育现象较为严重。因此针对赤 斑羚展开系统化研究,通过分子手段对遗传规律等生物学特性进行分析对于提高 种群繁育率、扩大种群规模有极大帮助。

1.1.3     赤斑羚昼间活动节律

动物生活的节律性与自身因素和环境因素有关。动物的行为时间分配可以反 映食物的可得性、自然环境及行为学特征。赤斑羚在西藏地区海拔与上海相差约 1500至2500米,且上海与西藏在光照与温度上也差异巨大。因此除去人工饲养 条件影响,自然环境的不同也会导致赤斑羚在上海地区部分行为特征区别于西藏 地区。

从野外捕获奠基者后,上海动物园经过一段时间建立了圈养赤斑羚种群,郑 建清、郭文利等人通过对此圈养种群一段时间的观察,发现了赤斑羚的 6 种行 为类型(郑建清, 2011):

( 1) 卧息行为:包括休息和反刍;

( 2) 站立行为:包括站息、攀爬和警戒;

( 3) 摄食行为:包括取食和采食;

( 4) 运动行为:包括走动、跑动、追逐和跳跃;

( 5) 修饰行为:包括修饰;

( 6) 其他行为:包括排泄、角斗和其他

赤斑羚还存在一些刻板行为。包括刻板行为在内,长时间的机械运动或不运 动对赤斑羚的身心健康极为不利。侯晓云等人在 2014 年对赤斑羚进行了丰容实 验(侯晓云等, 2014),包括食物丰荣、设施丰荣、环境丰荣,并研究发现:

( 1 )食物丰荣阶段:食物丰荣对赤斑羚行为几乎没有影响。

( 2)环境丰容阶段:增加了修饰、摄食、运动行为,减少了卧息行为,大 幅减少了刻板行为。但是站立与其他行为无变化。

( 3)在设施丰荣阶段,增加了修饰、运动行为,减少了卧息行为,小幅减 少了刻板行为。但是站立、摄食及其他行为无变化。

因此设法改善圈养赤斑羚环境质量,通过改良环境及设施提高赤斑羚生理、 心理质量,保证健康发育,才能更好提高繁育质量,为促进繁育工作的进行提供 支持。

1.1.3.1      夏季活动节律

上海动物园圈养赤斑羚夏季昼间活动节律如图所示(图 2)。六种行为类型 发生频次由多到少依次为采食行为、卧息行为、站立行为、修饰行为、运动行为、 其他行为,其中修饰、运动行为频率在 5%左右,其他行为仅 0.3%。卧息、采食、 站立三种行为发生频率与时间相关;运动行为发生频率与时间部分相关;修饰、 其他三种行为发生频率与时间基本无关。


 

image.png


采食行为在早上10点与下午3 点达到高峰,中午12点至下午2点与下午4 点至下午6点频次也较高。将采食高峰期与饲养员提供食物时间相比完全一致。 在饲养员饲养时间之外,赤斑羚也会在圈养笼中寻找草、树叶等食物进行采食, 这也是中午12点至下午2点与下午4点至下午6点这两个时间段频次较高的原 因。即使在饲养条件与自主采食的条件下赤斑羚昼间采食行为频次最高,但与其 他有蹄类动物相比赤斑羚采食行为所分配的时间远低于平均水平,甚至与许多食 草动物相比,采食行为所占时间百分比也属于较少的一类。

卧息行为高峰期在早上7点,中午11 点至12点,午后4点也较高。将卧息 行为与采食行为对比发现,所有的卧息高峰都发生在采食行为之后,并在采食过 程中也有部分卧息的行为。这是因为赤斑羚是反刍动物,在进食后需要进行反刍 促进消化,加速食物的吸收来补充能量(Corrales et al., 2007)。

站立行为在早晨9点左右到达高峰,为30%左右,但远低于采食与卧息行为, 其余时间平均在 10%左右浮动。与采食行为对比发现,在采食行为发生之前,站 立行为频次会有小幅或大幅提高。

运动行为在早晨9点左右到达高峰,为10%左右,其余时间平均在4%左右 浮动。与采食行为对比发现,现有的运动行为一般都是由采食行为引起。这与其 饲养环境有着密不可分的关联。因为活动空间狭小且地势平坦,与野生栖息地中 的险峻地势有极大差别( Marshall et al., 2020 ) 。在如此束缚的空间中,赤斑羚 常做的活动如:跳跃、攀爬等行为难以开展,才导致运动行为所占百分比如此低 下。

修饰、其他行为在一天中时间分布较为均匀,基本没有波动。修饰行为占3%左右,其他行为占 0.3%左右。

1.1.3.2   冬季活动节律

在圈养条件下,冬季赤斑羚昼间活动节律如图所示(图 3)。六种行为类型 发生频次由多到少依次为卧息行为、采食行为、站立行为、运动行为、修饰行为、 其他行为,其中运动行为频率在5%左右,修饰行为占3%左右,其他行为仅0.2%。 卧息、采食、站立三种行为发生频率与时间相关;运动行为发生频率与时间部分 相关;修饰、其他三种行为发生频率与时间基本无关。

与夏季昼间行为不同,冬季卧息行为占据50%以上时间。除早上10点、下 午2点至4点这两个时间段降低到40%左右,其余时间基本维持在60%至65%。 可以判断冬季赤斑羚除必须活动外基本以卧息行为为主(王爱善等, 2014)。

采食行为在早上9点与下午2点达到高峰,采食行为频次升高时卧息行为频次降低,成反比关系。与饲养员饲养时间对比,采食行为高峰期与饲养时间一致。 但与夏季行为不同的是,在饲养时间之外的时间,赤斑羚不在进行自主采食,而 是进行卧息,且采食行为更为快速,可能因为冬季食物提供能量不仅需要日常消 耗,还增加了产热消耗,因此高效进行采食并花费大量时间卧息是赤斑羚冬季进 化出的生存策略(Rogers et al., 2021),其他圈养草食动物行为分配也大致相同。 但对于野生个体来说,食物与圈养条件下营养搭配、产量充足不同,需要自己外 出觅食,且要提防天敌等不利条件的影响,势必需要花费更多时间与精力在采食 行为上。

站立、运动行为在早晨 9 点与下午 2 点左右到达高峰,为 20%左右,其余时 间平均在 12%左右浮动。和夏季行为规律一致,现有的站立、运动行为一般都是

image.png

Fig.3 Naemorhedus baileyi Activity Rhythm in Winner

 

由采食行为引起。其余运动行为与饲养员打扫时间一致。 修饰、其他行为在一天中时间分布较为均匀,基本没有波动。修饰行为占 3%左右,其他行为占 0.3%左右。

1.1.4    圈养赤斑羚发情行为

谢燕于 2006 年研究发现圈养赤斑羚在发情期间共有 23 种行为模式(表 1)。 雄性具有18种行为模式,其中15种为特有。雌性有10种行为模式,其中6种
为特有(谢燕, 2006)。5 种行为模式为雄性和雌性共有。赤斑羚发情状态在一 定程度上会受异性发情状态的影响。当雌性处于发情状态时,雄性发情频率明显 高于无雌性处于发情状态时。

行为模式

描述

咂舌

在爬跨前,雄性用舌头敲击上下嘴唇发岀“zeze”声。

下颌压

雄性以下颌抵压在雌性臀部上。

跟随

雄性紧跟雌性后并试图嗅闻雌性阴部。

前肢蹄踢

当雌性卧躺时,雄性用一伸直的前肢踢雌性身体使其站立。

叼尾

雄性将雌性的尾巴叼起并试图舔肛。

卷唇

雄性嗅闻气味后抬头并卷起嘴唇。

压脖

个体微下蹲,颈部下压并伸展,颌部微向上抬高,双角几乎与脖子平

行。

爬跨

雄性抬起前肢夹在雌性两侧。

口吻部和生殖区接触

雄性在后方接近雌性试图嗅闻或舔舐阴部。

顶头

两个个体轻触额头与角,似是要用力顶对方。

前额顶

一雌性低头,使用前额顶另一雌性以驱赶。

角顶

用角顶或是用角向上扫动。

角威胁

威胁来临时,将额头和角朝向威胁。

接近

个体径直向另一个体方向移动。

追逐

雄性追逐雌性。

翘尾

雌性将尾巴竖直抬起,似是做好交配准备。

嗅舔

雌性卧息时,雄性靠近并舔舐雌性的毛。

应激排尿

雌性在被雄性追逐或被雄性靠近时的排尿行为。

逃离

当雄性靠近时,雌性奔跑离开。

嗅尿

在雌性排尿时,雄性凑近嗅闻。

跳跃

雌性同时抬起前、后肢跳跃。

磨角

在不光滑物体上摩擦角

喷鼻

雌性在被雄性追逐时发岀声音。这种声音观察者在500m左右远能听

到。

表 1 圈养赤斑羚发情行为

Table 1 Behavior patterns of Naemorhedus baileyi

雄性赤斑羚的发情行为主要有:

(1)    探究行为:顺舌、接近、口吻部和生殖区接触、嗅尿、卷唇、嗅舔;

(2)    性行为:下颌压、爬胯;

(3)    其它行为:追逐雌性、前肢蹄踢。

嗅舔是雄性赤斑羚各种行为中岀现频率最高的,其余依次为口吻部和生殖区 接触、爬跨、跟随。压脖是雌性赤斑羚各种行为中岀现频率最高的。目前人工判 断雌性赤斑羚进入发情状态最明显的依据为翘尾(Gao et al., 2020)。

不同的雄性赤斑羚求偶方式不同,每个雄兽都有自己独特的求偶方式,在发 情期间比雌兽更活泼;且有性经验的雄兽求偶行为多于没有性经验的雄兽。因此 可以通过雌性赤斑羚对雄性赤斑羚,尤其是有性经验雄兽的求偶行为的反应来判 断雌性是否进入发情期。

赤斑羚发情周期与持续时间发对繁殖率有重大影响,其中受胎率与发情周期 长短有密不可分的关系( Damarany & Ghanem, 2020)。据观察,赤斑羚发情周 期越短,受孕几率越低,反之则越高。

1.1.5 赤斑羚繁殖生态

现有野外赤斑羚的研究几乎为零,因此作为世界范围内唯一一家人工圈养赤 斑羚的机构,现有关于赤斑羚的研究都于上海动物园进行,为赤斑羚研究发展提 供极大支持。

赤斑羚属于季节性多次发情动物,若其处于发情期时未发生交配行为或未受 孕,则在一段时间后会再次发情。赤斑羚的发情持续时间从愿意进行交配开始计 算至拒绝进行交配视为结束,平均在27±19h,浮动范围达6-72h,差异极大。 差异不仅表现在不同个体之间,在同一个体不同发情时期更为明显(Arakawaet al.,2020) 。交配次数一般每天10-20次。

之前通过赤斑羚发情行为观察研究发现,雌性赤斑羚发情期大约于10月初 至次年1 月末,有时在7月附近也可发情。雄性赤斑羚观测不到规律发情周期, 但当有雌性处于发情期时发情几率较平时稍高。雌雄赤斑羚平均发情周期在20 天左右,不同个体之间略有差异,但相同个体发情周期基本不变。

当处于发情期时,赤斑羚将可能产生如下一系列性行为(张词祖等, 1988):

(1)  求偶:雄性嗅闻雌性的尿液,口中发出“zeze”的叫声,舔舐雌性赤 斑羚以将唾液涂抹全身,试图嗅闻雌兽肛门。

(2)  交配:雄性求偶后阴茎迅速勃起进行爬跨,发情的雌性则站立不动, 并翘尾。完成姿势后雄性赤斑羚收缩腹直肌使阴茎插入阴道。

(3)      射精:雄性臀部前顶,完成射精。

(4)      交配结束:结束交配姿势后雄性离开,雌性则保持不动,发出几声叫 声后往前冲出,待距离稍远后转身以威胁姿势对准雄性。

若是为发情的雌性赤斑羚遇到雄性赤斑羚求偶时,常保持卧息姿势或进行逃 避以拒绝求偶。没有性经验的雄性一般无完整的性行为动力模式(Sullivan et al., 2018)。

雌性赤斑羚怀孕后,整个怀孕周期并无明显孕肚。若是仔细观察,孕兽在孕 龄2月左右时体型越加饱满,毛色越加光滑、深邃。孕期越长,卧息时间越长, 尤其喜欢潮湿阴凉处,行动时更加小心谨慎。雌性赤斑羚孕期平均为 238±24d, 范围为221-229d,不同个体间及同一个体各次孕期之间并无显著差异。

雌性赤斑羚繁殖潜力大于雄性赤斑羚,雌兽可从 16月龄起作种兽,并能连 年繁殖。繁殖周期从 1 岁开始至 14 岁左右结束,且尚未发现潜力上限。一只雌 兽一生可产仔12只左右。雄兽的繁殖能力较雌兽低,可从3岁起作种兽,并能 连年繁殖,繁殖潜力为 3岁至 11 岁左右。

圈养赤斑羚发情期与野生赤斑羚发情期相比有逐步紊乱的迹象,猜测原因可 能与自然环境和饲养条件有关。上海动物园与西藏不仅气候、季节不同,且圈养 赤斑羚没有食物、天敌等因素影响,逐渐消除了野生条件时对环境所产生的适应 性,即根据环境中有利及不利因素积极调整自身繁育周期以保证后代存活率。同 时,在饲养条件下,饲养员可以根据动物的体况调整饲料结构、饲养时间等 (Holtof et al., 2020)。在食物充足,影响丰富的条件下,圈养赤斑羚生殖机能 比野生赤斑羚更为活跃,且消除了环境限制因素,发情期逐渐随机化。

性成熟年龄除受自然环境和营养因素的影响外,还可受生活方式的影响 (Seigel, 1987)。野生赤斑羚并未研究出具体的繁殖周期。野外条件下,雌雄赤 斑羚在交配后分开生活,雄性独自生活,雌性和幼崽成群生活。因此,幼仔在成 长时只有雌兽刺激,未收到雄性刺激,性成熟可能较晚。圈养赤斑羚在交配后并 不分开饲养,幼崽与成年雌雄赤斑羚一起生活可使其受到双性刺激,加上圈养条 件下食物资源与环境资源更丰富、舒适,因此圈养赤斑羚幼崽,尤其是雌性幼崽 性发育时间更早。

环境温度、食物的丰富度都是影响幼崽出生的季节性因素(Wingate et al., 2021)。在适宜环境下出生的幼崽具有更好的生存条件和更充足的食物,这些因 素也是性成熟必要的先决条件。出生较晚的幼崽与出生早的幼崽相比性成熟会更 晚,更晚出生的幼崽或因获取不到充足资源从而导致死亡。基于季节性因素的影 响,赤斑羚的出生时期大多在5 月至7 月,这段时间内不仅温度较为适宜,且食 物来源较为丰富,最有利于后代的最大存活率。

在动物园观察发现,赤斑羚在幼年时期死亡率远高于成年时期。根据已有记 载分析,最有可能的原因是赤斑羚在幼年时期身体尚未发育完全,免疫系统的不 完善导致对于细菌与病毒的抗性过低,从而感染疾病(Tavares et al., 2020)。据 上海动物园记载,腹泻死亡是赤斑羚幼崽最高致死因素。

结合季节情况来看,夏季死亡率最高,依次是秋季、冬季、春季,并且死亡 率明显随季节变动而变化。证明赤斑羚的死亡率具有明显的季节性。而在季节性 变化因素中,最突岀的是温度季节性变化。夏季炎热的天气会导致中暑,冬季寒 冷的天气会导致肺炎,春季和秋季相比于气候条件夏季与冬季更利于赤斑羚生 存。但是秋天死亡率高于冬天,猜测可能的原因是因为5-7月大量幼崽岀生,因 身体因素导致抵抗力低下感染疾病导致大量幼崽在秋季死亡,因此秋季赤斑羚死 亡率较春季高。

1.1.6 上海动物园圈养种群变动原因分析

上海动物园谱系数据统计结果显示,雄性赤斑羚的繁殖年龄通常在2-14岁, 雌性3-11 岁,最晚雄性繁殖年龄为22岁,最晚的雌性繁殖年龄为18岁。平均 寿命为9.4年,雄性平均寿命9岁,雌性平均寿命9.8岁。其中 25%的个体活到 了13.4 岁, 10%的个体活到了18.3 岁, 5%的个体活到了20.1 岁, 1%的个体活 到了21.7岁。目前最大的在活个体年龄为15岁。1 岁之前的死亡率高达25%, 亚成体阶段(雄性0-2岁、雌性0-3岁)的死亡率高达18%。目前在活赤斑羚仅 剩12只,真正成功参与过繁殖的个体仅有3只(2雄1 雌);在性比方面,种 群中有雄性9只,雌性3只,性比为3: 1,严重失衡;从年龄分布来看, 3只雌 性中, 1 只雌性已达11 岁, 1 只处于亚成体阶段,处于繁殖高峰期的仅1 只。种 群呈严重衰退状态。死亡原因主要包括腹泻和打斗,在 30 例死亡个体中,有14 例死于腹泻, 5例死于打斗及 3例死胎。从上海动物园赤斑羚死亡个体分析发现, 圈养赤斑羚个体亚成体阶段死亡率明显高于其他年龄段。近十年,幼仔死胎率高 达 10%;腹泻所造成的死亡率接近 50%;而因雄性比例过高而造成的打斗致死 率达 16.7%。

上海动物园赤斑羚种群的奠基者仅有五只,且贡献值极不均衡,因此基因交 流不足,不可避免的近亲繁殖加剧了赤斑羚遗传多样性的降低和稀有等位基因的 丢失(Peters etal., 2021)。近亲繁殖不仅是圈养赤斑羚种群死胎率和亚成体死 亡率过高的原因,也是赤斑羚种群数量近几年持续下降的原因(Kappelhof& Weerman, 2020)。

根据上海动物园近几年数据记载,雄性赤斑羚数目在发展过程中与雌性赤斑 羚数目差距越来越大,从而导致雌雄性比越加失衡,雄性赤斑羚过多导致在对雌 性争夺时越加激烈。发情期中的雄性打斗导致了极高的致死率,且死亡的均为育 龄雄性赤斑羚,损失巨大。在动物园有限的空间内,仅有少数雄性个体能够繁育 后代,潜在遗传优势个体无法将优势基因输入到群体中(徐光岚等, 2020),而 大部分雄性个体只能在单性别群体中生活。 2000 年后,随着饲养管理水平的提 高以及对赤斑羚生物学研究的逐步深入,赤斑羚种群规模得以持续稳定增长。但 2013 年以后,由于疾病等原因,种群死亡数量增多,且性比逐渐失衡,导致育 龄雌性显著减少,种群开始严重衰退。且上海动物园赤斑羚种群是一个小种群, 种群大小受出生率和死亡率影响显著,而各种随机灾害的直接作用更易加速种群 灭绝过程(ZUrcher & Burkart, 2021)。

1.2         ELISA 激素测定研究简介

1.2.1    三种待测生殖激素简介

生殖激素属于类固醇激素,在动物睾丸、胎盘、肾上腺细胞皮质、卵巢等各 种生殖器官中依靠胆固醇经一系列酶促反应而形成(Wang et al., 2021)。最终产 物由胆固醇种类、产生器官中酶的种类与活性共同决定。雄激素、雌激素和孕激 素统称为生殖激素(sexhormone)。雌性动物体内最主要的生殖激素为雌激素和 孕激素。雄性动物体内最主要的生殖激素为雄激素。其主要作用包括维持第二性 征,促进性器官发育与生长、维持性功能等(Andleeb etal., 2021)。

动物体内生殖激素的分泌量与变化率可以反映出生殖或应激等生理活动,属 于一种较客观、直接的观测方法。

1.2.1.1 雌二醇

雌二醇(estradiol)又名“动情素”、“求偶素”,属于雌激素中含量最多, 活性最强的一种。雌二醇的生物合成反应过程通常呈现出一种周期性的的变化。 在经卵泡、黄体和胎盘等生殖器官合成后,输送至子宫、阴道、输卵管、垂体等 靶器官(Martins et al., 2020)。怀孕雌性在妊娠时,母体和胎儿血液中脫氢异雄 酮(DHA)可通过胎盘组织经转化变成雌二醇(E2)和雌酮(E1) ( Sriprasert et al., 2020)。雄性也可产生雌二醇,主要合成器官为睾丸。

雌二醇浓度属于医学检查时一个较为重要的指标,通常用来检测雌性下丘- 垂体-生殖腺轴功能或判断是否妊娠。糖尿病孕妇或多胎妊娠会导致雌二醇浓度 过高。雄性在患有某些严重疾病时,血液中睾酮的保护性降低致使雌激素相对增 多(Garcia et al., 2021)。

1.2.1.2   孕酮

孕酮(progesterone)也称黄体酮,是作用最强的的孕激素,也是许多其他 类固醇激素的前体。孕酮分布广泛,对于哺乳动物主要由雌二醇对诱导孕酮受体 合成后,由卵巢分泌,最后于黄体产生(Hoskins et al., 2021),用于妊娠相关活 动。若是已处于妊娠期则主要生成器官变为胎盘,含量为黄体期的 10-20倍。同 时还可在非哺乳动物身体中合成,如部分鸟类和鱼类,作用是促进输卵管蛋白的 合成。雄性动物体内孕酮来源主要是雄激素产生过程中的中间产物。

孕酮一般与雌激素共同作用,在非妊娠时期确保月经等正常生理活动、促进 乳腺发育(Donnez & Dolmans, 2021)。在妊娠时期调节下丘脑-垂体-卵巢轴, 激活子宫与乳腺,使子宫由增生期转为分泌期,为卵细胞着床、提供胚胎营养、 维持妊娠做准备。

测定孕酮浓度可以检测雌性哺乳动物卵巢功能是否正常,也可检测妊娠期哺 乳动物胎盘功能是否正常(Zhang et al., 2019),对于雌性妊娠各个时期有重要 帮助。

1.2.1.3    睾酮

睾酮(testosterone),又称睾丸素,是雄激素中活性最强的一种激素,由雄 性的睾丸间隙细胞生成。其作用是维持第二性征和正常性腺功能,可促进新陈代 谢并增强肾脏、肝脏中的氮存储功能。雌性卵巢也可分泌睾酮,可促进蛋白质合 成代谢等(Chasland et al., 2021)。

与雌二醇的分泌不同,睾酮没有明显的周期性(Raymond et al., 2021)。睾 酮对雄性产生作用的方式是以血清双氢睾酮(DHT)形式使睾酮受体活跃化。对 雌性产生作用的方式是转化为雌二醇使某些雌激素受体活跃化。

医学上血清睾酮浓度是某些病症判断的重要指标,血清睾酮浓度过高在雄性 中多为睾丸良性细胞瘤、皮质醇增多症等;在雌性中多为多囊卵巢综合症、肥胖及中晚期孕妇等。血清睾酮浓度过低在雄性中常见于性功能低下、睾丸发育不全症、骨质疏松症等;在雌性中多为高催乳素血症等。

1.2.2      生殖激素与发情期关联

许多温带的有蹄类动物都是季节性繁殖(丁英,2007) 。为使雌性在资源较 为丰富的时期分娩,许多季节性繁殖动物在秋季时性腺便开始活动,雄性求偶时 期尽可能契合雌性发情时期。雌性在秋冬季受精后经漫长孕期,使得春夏交接时 出生的幼崽具有适合生长发育的温度和丰富的食物以供生存,这就是动物进化出 的环境适应性动物自身内部机制与环境变化共同影响了动物的季节性繁殖,其中 性激素对于季节性繁殖的影响最大。在有蹄类动物中,睾酮影响了雄性的发情行 为,孕酮影响了雌性的发情行为。许多研究已证实这一点,如成年公羊的发情行 为在秋季最为频繁,经测定秋季是其睾酮水平最高的时期,以此证明成年公羊的 发情行为与激素水平呈相关关系。除此,驯鹿和马鹿因睾酮升高而导致在发情期 时性行为极其明显,并具有极高攻击性。还有许多有蹄类动物在研究中也表现出 相似的特点。

动物发情周期的生殖激素波动状况可以反映出该种群的繁殖周期、怀孕、性 成熟和季节性变化的相关信息,为种群数量控制和繁殖研究等提供科学依据。血 清和血浆激素的测定一直被认为是研究动物激素水平,包括生殖激素最直接的方 法。但是血液样品往往较难获得,或是对动物损伤较大,使用粪便生殖类固醇激 素代替测定已逐渐成为趋势。

生殖类固醇代谢物的排泄情况可以反映动物性腺活动的规律(黄华苑, 2014)。因此,使用采集尿样或粪样等非损伤采集法进行生殖激素的测定已经在 广泛使用。虽然不同物种生殖激素分子结构与组成类似,但是不同物种的粪便代 谢方式与排泄方法存在不同,当使用粪便进行生殖激素测定时应考虑不同物种之 间差异,不能完全参考另一物种的测定方式。

1.2.3      ELISA 激素测定的原理与方法

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,简写 ELISA)指将 可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进 行免疫反应的定性和定量检测方法( Clark & Adams, 1977)。

1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定用于 IgG 定量测定 的文章,使得 1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量 物质的测定方法(Engvall etal., 1971)。这一方法的基本原理是:

(1)  在保持抗原或抗体免疫活性的条件下,促进其聚集在特定固相载体。

(2)  在特定酶的作用下将抗原和抗体转变为酶标抗原和抗体,转变后既保 留了原先抗原和抗体的活性,也保留酶的活性。测定时先后将待测样本与转化后 的酶标抗原或抗体添加在固相载体上,形成抗原抗体复合物。

(3)  将固相载体进行洗涤,洗涤后剩余抗原抗体复合物,且结合在固相载 体上的酶量与待测样本量成一定比例。

(4)  加入酶反应底物,抗原抗体复合物被酶催化成有色产物。因为酶的高 效性使方法具有极高敏感度。

目前已经广泛应用的 ELISA 方法包括直接法、间接法、夹心法、竞争法 ( Engvall, 1971 )。

(1)    直接法:直接法是将抗原固定在预包被板后,直接使用酶标抗体检测 抗原。与其他ELISA测定方法相比较而言,直接法的优点在于操作方式简单, 检测速度快,不需要用到二抗,避免了交叉反应的发生,测定结果更加准确。缺 点在于直接法中的抗原抗体并非特异性固定,样本中的所有蛋白质(靶蛋白及其 他杂质蛋白)都会与预包被板相结合,导致较高的实验背景。而且直接法中每种 靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗,实验不太灵活。另外由于没有使 用二抗,信号没有被放大,降低了测定的灵敏度。因此直接法通常用于对抗原的 免疫反应进行分析。

( 2)间接法:间接法是先将抗原结合到预包被板上,随后分两步进行检测: 首先加入检测抗体与抗原特异性结合,随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。 与直接法相比,间接法用到酶标二抗,具有更高的灵敏度,也需要更少的标记抗 体,更经济。间接法还提供了更大的灵活性,因为不同的一抗能够与单一标记的 二抗一同使用。但是间接法的缺点在于存在交叉反应的可能性(酶标二抗直接与 抗原结合),可能会增加实验背景,同时与直接法相比,间接法实验多了二抗孵 育的步骤,实验周期增长。因此间接法通常用于测定样品中总抗体的浓度。

(3)夹心法:夹心法需要用到配对抗体(捕获抗体和检测抗体),其实验 原理是将捕获抗体结合到预包被板上,通过捕获抗体固定抗原,随后通过直接法 或间接法的方式进行检测。在夹心法实验中,最重要的是对配对抗体进行验证, 确保配对抗体能同时与抗原结合。夹心法实验先将捕获抗体固定于预包被孔中, 然后加入分析物或样品,最后加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体,则可称 为直接夹心ELISA;如果检测抗体不带有标记,则还需要使用酶标二抗与检测抗 体结合,这种称为间接夹心ELISA。夹心法的灵敏度高,它比直接或间接法敏感 2-5 倍;同时夹心法使用两种特异性抗体与抗原结合,拥有很高的特异性。另外 夹心法能够通过直接或间接的方式进行检测,有着不错的灵活性。但是缺点是对 配对抗体要求很高,如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体,则 需要进行配对抗体定制并进行优化,因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反 应是非常重要的。因此夹心法尤其适用于复杂样品的分析,因为抗原不经纯化仍 具能有高灵敏度和特异性(例如测量免疫应答中的细胞因子水平)(Zhu & Hsieh, 2021 )。

(4)竞争法:竞争法也称为阻断法,是所有 ELISA 实验中最复杂的,但是 以上介绍的3种ELISA类型都适用于竞争法的形式。竞争法主要用于通过检测 对预期信号输出去测量样品中抗原或抗体的浓度:在竞争法实验中,样品中的抗 原或抗体竞争性的结合特定数量的酶标抗体或抗原。样品中抗原浓度越高,输出 信号越弱,信号输出与样品中抗原的量成反比。

四种ELISA法总结如下(表2):

ELISA 法

优点

缺点

适用范围

直接法

步骤少、周期短、交叉反

背景高、灵活性差、灵敏

分析抗原的免疫反应;


应低;

度低;


间接法

灵敏度高、更经济、更灵

实验周期长、交叉反应

测定样品中总抗体的浓


活;

高;

度;

夹心法

灵敏度高、特异性高、更

对配对抗体要求高;

对复杂样品进行分析;


灵活;



竞争法

样品纯度要求不高、重复

操作繁琐;

用于只有一种抗体可用


性好、灵活性高;


于目标抗原的情况,也适

用于检测不能被两种不

同抗体结合的小抗原; 

表 2 四种 ELISA 法优缺点总结

Table 2 Summary of the advantages and disadvantages of the four ELISA

1.2.4    粪便中激素进行 ELISA 测定的可行性与准确性分析

以往通常采用采集血液样本进行ELISA激素测定分析,以检测动物体内生 殖激素或其他类固醇激素的波动变化情况。采集血样不仅对动物本身有所伤害, 采集的血液样本或因采血时刺激导致激素水平异常影响分析结果,尤其赤斑羚属 于性情机警、胆小的动物,采集血样无疑会对其造成极大刺激,不仅血液样本无 法采集或采集后激素水平测定值极大偏离正常水平,严重者会因采血刺激导致死 亡。若使用麻醉剂后进行血液样本采集,仅能测试极少样本。若需长期、稳定收 集样本,使用麻醉剂是完全不可行的方法,长期使用麻醉剂对动物伤害极大,甚 至导致死亡。

采用采集粪便样本进行ELISA激素测定的方法与采集血液样本进行激素测 定的方法相比优势在于:

(1)  不影响动物自身任何活动。粪便采集工作与赤斑羚活动可以完全分离, 不需要对赤斑羚进行任何操作,可以在独立于赤斑羚外的空间采集其粪便样本。

(2)  对动物生理、心理无伤害。粪便采集免去了采血针与麻醉针的使用, 即免去了使用采血针时对动物造成的惊吓,也免去了使用麻醉剂对动物生理造成 的不利影响。

(3)  测定值更加准确。若是在人体或其他理想状态下,采集血液样本测定 比粪便样本更准确,但是对于动物来说,人为靠近并采集血液样本势必会对其产 生惊扰,从而导致内分泌紊乱,影响血液中激素值的变化,测定结果势必会造成 极大偏离。

(4)  可以长期稳定收集样本。在不用担心对实验动物造成任何生理、心理 伤害的前提下,可以进行长期、稳定研究,也可测定因特殊处理后短期内的激素 变化水平,为研究提供了多种方向。

因此,采集粪便样本进行激素测定可以是一种更准确、更稳定、更高效的方 式。

常用的激素测定方法主要包括生物学方法,化学方法和免疫测定法(Chenet al., 2021)。目前已经在粪便激素检测中应用了放射免疫法和酶联免疫法。放射 免疫即生物化学中的免疫分析,具有极高的灵敏度,是目前检测生殖激素使用的 最广泛方法。但是这种方法会带来不同程度的辐射影响:一是放射性药物对操作 者的辐射。二是放射性废物对环境的污染。因此,对实验室保护条件的要求很高, 不应广泛使用。

酶联免疫测定的灵敏度低于放射免疫测定,但比放射免疫测定简单,安全。 它易于推广。随着ELISA灵敏度的进一步提高,这一测定方法已应用于医学、 动物学等多个领域。2015年李一经等人同时使用ELISA和RT-PCR检测48份猪 流行性腹泻病毒(PEDV)的临床粪便样本,结果显示,ELISA阳性检出率为 39.6%,而RT-PCR检测的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具 有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测(李一经等, 2015)。1993年Haque Rashidul等人使用粪便ELISA直接诊断致病性溶组织内 阿米巴感染,并在结论中表述通过ELISA法测定OCT灵敏度更高,可广泛用于 临床检查(Rashidul etal., 1993)。1991年刘宜升、毛克强等人使用用ABC-ELISA 双抗体夹心法检测人工感染家兔粪便华支睾吸虫抗原(CsAg)(刘宜升等,1991), 2003年张晓燕等人采用ELISA对人粪便样品进行沙门氏菌检测(张晓燕等, 2003)。这些成功案例说明粪便中激素进行ELISA测定不仅可行性高,且结果 更准确、快速。

虽然酶联免疫测定在是一种高效便捷的方法,但仍存在一些可能导致误差的 因素,从而造成假阳性或是假阴性的结果。因此需要针对产生误差的原因寻找解 决办法。常见的误差原因及解决方法如下(Gates etal., 2020):

(1) HD-HOOK效应:由于在“一步法”中待测抗原总量过高,使得测定值 随着抗原总量增加反而迅速下降。通常发生在固相法试验过程中,造成“假低值” 甚至“假阴性”错误结果的特殊效应。可运用稀释测定法、初筛试验方法可以降 低待测抗原总量。也可设计预试验,确定合适粪便总量。

(2) 边缘效应:抗原抗体反应与酶反应受温度影响较大,在室温操作时, 96孔板周边孔与内部孔升降温速率差别较大,导致实验结果不同。因此,若室 温和37°C悬殊过大时,可加封封板膜。

(3) 弥散限制:在固相法中抗原抗体结合、底物与酶的接触、转换的信号 产物弥散都必须穿过液面的Nernst层,也称液固屏障,使反应速率受到限制。 可采用振荡、离心、微波或超声等方法,可使Nernst层变薄,从而加速反应速 率。

(4) 激素提取液中存在干扰物质:通过稀释试验、平行试验或回收率试验 可以判断提取液中是否存在干扰物质。若确认存在干扰物质后,需要选择最合适 的激素提取方法来尽量消除这些干扰物质,常用的提取溶剂是乙醇、甲醇和二氯 甲烷。

1.3     研究目的

1.3.1    赤斑羚粪便样本保存时效性

在某些野外条件或者圈养条件下,大多数情况下都会出现无法及时对采集的 粪便样本进行分析的情况,所以寻找一种良好的保存方式是进行粪便激素研究的 先决条件之一。迄今为止的研究表明,物种不同、保存时间不同、保存方式不同 都会影响粪便内的激素水平随时间变化呈现巨大差异。但目前还没有针对赤斑羚 粪便保存时效性的研究。因此,针对赤斑羚进行赤斑羚粪便内激素水平时效性研 究就显得至关重要。

目前根据其他物种粪便激素保存时效性的研究可以推断醇类(如甲醇、乙醇 等)、冷冻、抗生素、干燥等方法均有助于某些物种粪便的保存。据此合理推测 这些方式也同样适用于赤斑羚粪便中激素保存,同时,也合理猜测在室温条件下, 对赤斑羚粪便不做任何处理对其中包含的生殖激素是否有显著影响。因此设计实 验,将赤斑羚粪便经过干燥、冷冻、抗生素、醇类并添加一组不做任何处理,来 与粪便即时测定出的激素值进行比较,判断此种方式保存下的粪便激素水平是否 呈现差异,差异是否显著。

本实验不仅对何种储存方式进行判断,也对储存时间进行测定。因此每一种 不同的处理方式都设置了时间梯度,分别是15d、30d、90d和150d,以此来观 察某种处理方式在第几天时出现了显著差异。如用冷冻方式保存的粪便样本在第 30d时与粪便即时测定出的激素值相比出现了显著差异,则判定冷冻储存方式有 效储存时间为30d。

1.3.2    赤斑羚发情周期判定

上海动物园养殖场目前圈养赤斑羚个体数量仅10余只,且适宜繁育个体数 量仅为 3 只(2雄1 雌),还存在种群内性别比例严重失衡的问题,近年来已出 现个体数量下降趋势。为了提高赤斑羚繁育率,扩大种群内个体数量,需要采取 科学的辅助措施提高配对率。

在此之前,不仅赤斑羚,绝大多数动圈养动物进行合笼都是根据发情行为判 断,或是按照某固定周期或经验模式。仅根据发情行为进行合笼是一种较为主观 方式,与饲养员对于该物种发情行为的了解经验有极大关系。若是仅按照某固定 周期或经验模式判断合笼时期,则会忽略此物种发情期变化情况,若是赤斑羚该 类季节性繁殖物种,在圈养条件下,一直保证较适宜的生存条件与丰富的食物储 存,赤斑羚的发情周期较野生赤斑羚相比势必会产生变化,导致季节性不如以往 明显。经过长期偏离后,发情周期与原先经验模式下判断的发情期误差较大。据 上海动物园养殖场记载,圈养赤斑羚发情周期较原先相比已经开始紊乱,不再是 原先冬季发情、春季产仔的规律。

由于目前上海动物园饲养场赤斑羚数目极少,且育龄赤斑羚仅为 3 只,若是 仅根据主观经验进行合笼风险极大,雌雄赤斑羚两方未均处于发情期时极可能发 生打斗行为,造成赤斑羚受伤甚至死亡的情况。在个体数目极少的情况下,未避 免这种情况发生,我们希望建立一个客观的发情期预测模型为合笼时期提供一个 有效数据支持。

为了建立发情期预测模型,需要每天收集雌雄赤斑羚粪便样本进行激素测 定,参与测定的雌雄赤斑羚个体越多,收集的样本量越大,则结果越准确。通过 每天测定的激素值对雌雄赤斑羚分别绘制年度波动曲线图,根据图表波峰波谷值 判断该年何段时间最可能处于发情期内。最后根据数年数据综合观察,总结统计 出雌性与雄性赤斑羚各自发情周期在一年中何段时间,在重合期进行合笼。采用 粪便样本进行激素测定的方式为此种长期、稳定的收集方式提供了有效支持。

最后可以根据主观与客观结合判断方式共同确定最合理的合笼时间,即在 发情期预测模型的时间内,根据饲养员对该物种发情行为的判断及以往合笼经验 综合判断合笼时期。采用此种新型合笼方式对赤斑羚繁育率提高、扩大种群中个 体数量,为今后野外放归提供强有力支持。

天天论文网
专注硕士论文服务

24小时免费热线

SERVICE ONLINE

13503820014

手机扫描二维码

收缩
  • 电话咨询

  • 13838208225